“黑美人”土豆黃酮提取及抗氧化活性

李彩霞，高海寧，焦 揚，吳冬青，張 勇,*，羊 艷

(1.河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅 張掖 734000；3.河西學院化學化工學院，甘肅 張掖 734000)

“黑美人”土豆黃酮提取及抗氧化活性

李彩霞1,2，高海寧1,2，焦 揚1,2，吳冬青2,3，張 勇1,2,*，羊 艷1

(1.河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅 張掖 734000；3.河西學院化學化工學院，甘肅 張掖 734000)

對黑美人土豆黃酮提取工藝及抗氧化性進行了研究。結果表明，影響黑美人土豆黃酮提取率的主要因素為溫度、料液比和乙醇體積分數；最優工藝條件為提取溫度78℃、乙醇體積分數62%，料液比1:35(g/mL)。在此工藝條件下，最大響應值(1.04%)和實驗測定值(1.03%)相符合，說明響應面法優化黑美人土豆黃酮是可行和有效的。黑美人土豆黃酮提取物與VC、蘆丁相比較清除DPPH自由基能力大于蘆丁小于VC；黃酮質量濃度在不高于20μg/mL時清除ABTS自由基的能力和抗氧化力大于VC，但始終大于同質量濃度的蘆丁，結果顯示黑美人土豆黃酮提取物具有顯著的抗氧化活性，可以作為潛在的抗氧化劑或功能性食品資源。

“黑美人”土豆；黃酮；提取工藝；抗氧化

“黑美人”土豆是由甘肅蘭州隴神航天育種研究所育成的新品種，其秧苗是黑紫色，表皮呈黑色，薯肉為黑色，它含有脂肪、蛋白質、及少量的鈣、鎂、鉀等多種營養成分，素有“地下蘋果”和“第二面包之稱”[1]，黑美人土豆富含的花青素[2]，具有抗癌[3]、抗衰老、抗病毒[4]、抗氧化[5-6]、保肝[7]、美容和防治高血壓等多種藥理和保健作用，是一種藥食兼用的特色健康食品。目前“黑美人”土豆研究僅見多酚氧化酶活性[8]、引種栽培[1]、有關花青素的提取[9]及色素穩定性[2]方面的報道，而對其黃酮提取工藝與其抗氧化性方面研究尚未見報道。

本實驗在前期工作的基礎上，利用乙醇回流法提取黃酮，采用中心組合設計，通過響應面分析法對影響黑美人土豆黃酮的主要工藝參數進行優化；并且對其清除DPPH、ABTS自由基以及總抗氧化力進行了測定，為建立黑美人土豆黃酮的優化條件以及為黑美人土豆活性成分的開發利用提供信息資料。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

黑美人土豆購于民樂縣新天鋪，清洗掉泥土，用不銹鋼刀具切片，105℃滅酶，真空干燥、粉碎避光保存。

蘆丁(rutin) 國藥集團化學制劑有限責任公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等藥品為國產分析純；總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒 南京建成生物工程研究所；二苯代苦味肼基(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical，DPPH)、2,2'-聯氮-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸(ABTS) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；CR21GⅡ高速冷凍離心機 日本日立公司；SHZ-2000型雙配套循環水式多用真空泵 河南省鞏義市英峪予華儀器廠；S24分光光度計 上海棱光技術有限公司；RE-2000A旋轉蒸發器 鞏義市京華儀器有限責任公司；AE200電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮的提取

1.3.1.1 單因素試驗

稱取1.00g黑美人土豆粉末于100mL蒸餾瓶中，按不同料液比，加入一定量不同體積分數的乙醇，在一定溫度和時間下回流提取，冷卻后，5000r/min離心10min，上清液置于50mL容量瓶中，并用相應體積分數的乙醇定容，用于黃酮含量的測定。

1.3.1.2 黑美人土豆黃酮提取條件試驗設計

在單因素試驗基礎上，以主要影響黑美人土豆中黃酮提取的乙醇體積分數、溫度和料液比3個因素為自變量，進行3因素5水平的試驗，因素水平編碼見表1。中心組合試驗設計(CCD)方案[10]及結果見表2。

表1 中心組合試驗因素水平編碼表Table1 Factors and their coded levels for central composite design

根據CCD設計組合方案進行試驗，用統計軟件SAS9.2對試驗數據進行回歸分析，推測出最佳提取工藝參數。

1.3.2 黃酮含量的測定

1.3.2.1 測定波長的確定

根據蔣益虹[11]的方法用蘆丁標準液與黑美人土豆黃酮提取液進行顯色反應，在400～600nm下掃描，確定黃酮測定波長。

1.3.2.2 標準曲線的繪制

準確稱取蘆丁標準品20.00mg，用少量75%乙醇溶解，轉移至100mL容量瓶中，并定容至刻度。即蘆丁標準品質量濃度為0.20mg/mL，冷藏備用。精確吸取蘆丁標準溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mL，分別置于10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.30mL，搖勻，靜置6min；然后加入10%硝酸鋁溶液0.30mL，搖勻，靜置6min；再加入4%氫氧化鈉4.00mL，用30%的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，靜置15min，以試劑空白為參比，在502nm波長處測定吸光度。以吸光度(y)為縱坐標、蘆丁質量濃度(x，mg/mL)為橫坐標，制作標準曲線，得到回歸方程為：y＝1.0258x＋0.004，R2＝0.9998。

1.4 抗氧化活性的測定

1.4.1 抗氧化物制備

在上述優化條件下提取的黑美人土豆黃酮提取液，在30～40℃減壓濃縮，濃縮液黃酮質量濃度為2.39mg/mL，用75%乙醇溶液稀釋成質量濃度為5.00、10.00、15.00、20.00、25.00μg/mL的黃酮溶液，以相應質量濃度的VC和蘆丁為陽性對照。

1.4.2 黃酮提取物對DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基的清除能力采用呂英華等[12]的方法。1.4.3 黃酮提取物對ABTS＋自由基的清除能力

對ABTS＋自由基的清除能力測定參見文獻[13]有改動，ABTS＋工作液：精密稱取40.00mgABTS，加入1.0mg/mL的過硫酸鉀溶液8.0mL，密封后避光靜止反應16h，定量轉移到250mL的容量瓶中，加32.00mL蒸餾水，用無水乙醇定容至刻度，放置10h后使用。根據測定吸光度的范圍可用80%乙醇調整質量濃度。

提取物對自由基清除能力測定，準確吸取不同質量濃度的黑人土豆黃酮溶液0.50mL，分別加入0.80mL的ABTS＋工作液，然后加入2.70mL的80%的乙醇溶液，準確反應6min，在734nm測定吸光度Ai，樣液對照組以等體積無水乙醇代替ABTS＋溶液(Aj)，對照組以等體積75%乙醇代替樣品溶液(A0)，并以等體積75%乙醇和80%乙醇混合液作空白調零。清除率按下式計算，并以相應質量濃度的VC和蘆丁為陽性對照。

1.4.4 黑美人土豆黃酮提取物的總抗氧化力測定

總抗氧化力測定嚴格按照試劑盒提供的方法，樣品在520nm處測定吸光度，總抗氧化力的確定在37℃時，每毫升提取樣品使反應體系的吸光度每增加0.01時為一個總抗氧化能力單位。

式中：AS為樣品管吸光度；A0為對照管吸光度；3.7為反應體系總體積；0.2為測定樣品體積；n為樣品稀釋倍數。1.4.5 數據處理

采用SAS9.2統計軟件和Origin7.5進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 黃酮測定波長的確定

蘆丁標樣和黑美人土豆黃酮提取液通過NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色后，在400～600nm可見光區域掃描。結果顯示，標樣和樣液顯色后最大吸收峰在502nm處，故選擇502nm作為黃酮測定波長。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取溫度對黃酮得率的影響

準確稱取樣品1.00g，用體積分數為75%乙醇的作為提取劑，料液比1:20(g/mL)，分別在溫度20、40、60、80、100℃下提取1h，測定提取液中黃酮的得率，結果見圖1。黃酮得率隨溫度升高而增加，當溫度為80℃時，黃酮得率明顯升高，之后上升比較緩慢，因為溫度較高時導致黃酮物質結構發生變化，從而影響其活性[14]，因此選擇提取溫度不宜超過80℃。

圖1 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction efficiency of flavonoids

2.2.2 料液比對黃酮得率的影響

圖2 料液比對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of flavonoids

準確稱取樣品1.00g，以體積分數75%的乙醇為提取劑，提取溫度80℃，分別按料液比1:10、1:20、1:30、 1:40、1:50(g/mL)下提取1h，測定提取液中黃酮的得率，結果如圖2。隨著料液比的增大，黃酮得率相應增加，當料液比為1:40(g/mL)時，黃酮得率最高，之后黃酮得率下降，這是由于料液比達到一定比值時，黑美人土豆中黃酮已提取完全，故適宜的提取料液比為1:40(g/mL)。

2.2.3 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

準確稱取樣品1.00g，在提取溫度80℃、料液比為1:40(g/mL)條件下，分別以體積分數為25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%和95%的乙醇提取1h，測定提取液中黃酮的得率，結果見圖3。乙醇體積分數對黃酮提取影響比較大，隨著體積分數的增加黃酮得率下降，乙醇體積分數越小提取率越大，說明黑美人土豆中的黃酮類化合物易溶于水，但是乙醇體積分數越小，后續處理比較費時。綜合考慮以65%體積分數的乙醇為提取劑。

圖3 乙醇體積分數對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of flavonoids

2.2.4 提取時間對黃酮得率的影響

準確稱取樣品1.00g，在溫度80℃、料液比1:40(g/mL)、體積分數65%的乙醇溶液中分別提取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h，測定提取液中黃酮得率，結果見圖4。隨著提取時間的延長黃酮的提取率增大，但變化幅度較小，在提取時間為1h時提取率為1.11%，在3.5h時提取率為1.28%，說明提取時間對黃酮提取率影響不顯著，因此以下實驗固定提取時間為1h，以影響黃酮提取率最大的3個因素進行CCD組合設計。

圖4 提取時間對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of time on the extraction efficiency of flavonoids

2.3 黃酮類化合物提取工藝回歸模型的建立及響應面分析

2.3.1 回歸方程的建立與檢驗

在單因素試驗的基礎上，對影響黃酮得率的主要因素溫度、乙醇體積分數和料液比采用CCD試驗設計，試驗結果見表2 。

采用SAS 9.2軟件進行統計分析，得到黑美人土豆中黃酮類化合物的提取率(Y)與溫度(X1)、乙醇體積分數(X2)和料液比(X3)各因素變量間的函數關系：

為了說明回歸方程的有效性及各因素對提取率的影響程度，對回歸方程進行了方差分析，結果見表3。

表2 試驗設計方案及結果Table2 Central composite design and results

從表3可以看出，溫度、乙醇體積分數、料液比以及乙醇體積分數二次項與料液比二次項對黃酮類化合物提取率影響達到極顯著水平(P＜0.01)；溫度二次項、溫度與乙醇體積分數的交互項、溫度與料液比的交互項對黃酮類化合物提取率影響差異顯著(P＜0.05)。同時對回歸方程進行檢驗，回歸模型檢驗極顯著(P＜0.01)，此模型決定系數R2為96.91%，校正后R2為94.77%，表明方程擬合較好。變異系數為4.72%，說明實驗操作可信，該方程與實際情況擬合很好，能夠正確反映黑美人土豆黃酮的提取率與溫度、乙醇體積分數和料液比之間的關系。

表3 回歸方程的方差分析Table3 Variance analysis of regression equation

2.3.2 響應面分析與優化

圖5 各因素交互作用對黃酮得率的影響Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of extraction parameters on the extraction efficiency of flavonoids

從圖5A可以看出，隨著溫度的升高，黃酮的提取率逐漸增加；隨著乙醇體積分數的增加，黃酮得率先緩慢上升，后迅速下降，其原因是乙醇體積分數不同，極性也不同，當乙醇體積分數在45%～65%之間，溫度在80℃附近，響應值達到最大。

從圖5B可以看出，溫度對黃酮得率影響顯著，隨著溫度的增加，黃酮得率增加；隨著料液比的增加，黃酮得率先增加后減少，溶劑量加大，大量的雜質如多糖，蛋白等溶解出來，影響了黃酮的溶解性[15]，溫度在80℃附近，料液比在1:40附近時響應值最大。

從圖5C可以看出，隨著料液比的增加，黃酮得率先迅速增加，后緩慢下降，隨乙醇體積分數的增加，黃酮得率先緩慢上升，后迅速下降，當乙醇體積分數在在45%～65%之間，料液比在1:40附近時提取率最大，料液比對黃酮得率影響更大。

從圖5分析可知，3個因素中溫度對黃酮的提取率響影響最大，表現為曲線的傾斜度大，料液比和乙醇體積分數變化比較平緩，說明這兩個因素對響應值影響較小。通過嶺脊分析各因素最佳條件的編碼值為：X1=0.87345、X2=-0.14323、X3=0.46538，即提取溫度78℃、乙醇體積分數62%、料液比1:35(g/mL)，對優化結果進行驗證，其實測值為1.03%，模型預測值為1.04%，實測值與預測值非常接近，證實了該模型的有效性。

2.4 黑美人土豆黃酮提取物抗氧化活性分析

2.4.1 對DPPH自由基清除活力

DPPH自由基是一種穩定的自由基，它被廣泛做為抗氧化劑評價自由基清除活力的一種工具[16]。黑美人土豆黃酮對DPPH自由基的清除作用如圖6所示。隨著黑美人土豆黃酮提取物、VC和蘆丁質量濃度的增加，對DPPH自由基的清除率增加，在質量濃度為25μg/mL時，對DPPH自由基的清除率分別為47.66%、91.50%和32.71%。以上數據說明，黑美人土豆黃酮提取物對DPPH自由基具有清除作用，其清除作用優于蘆丁而小于VC。

圖6 黃酮、VC和蘆丁對DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical scavenging activity of flavonoids from “Black Beauty” potatoes, VC and rutin

2.4.2 對ABTS自由基清除活力

圖7 黃酮、VC和蘆丁對ABTS自由基的清除作用Fig.7 ABTS radical scavenging activity of flavonoids from “Black Beauty” potatoes, VC and rutin

ABTS自由基清除法目前已廣泛用于生物樣品的總抗氧化力測定。在反應體系中，ABTS經氧化后生成穩定的藍綠色ABTS水溶性自由基，抗氧化劑反應后使其溶液褪色，特征吸光度降低，因此根據溶液的褪色程度，來判斷該提取物或者被檢測物的總抗氧化力[17]。黑美人土豆黃酮提取物對ABTS自由基清除活力清除作用如圖7所示。對ABTS自由基清除率隨著黃酮提取物、VC和蘆丁質量濃度增加而增加，其相關系數分別為r＝0.9876，r＝0.9974和r＝0.9856，均呈線性相關。在質量濃度為25μg/mL時，黃酮提取物、VC和蘆丁對ABTS自由基清除率分別為74.61%、77.39%、31.21%，黃酮提取物和VC對ABTS自由基IC50分別為14.60μg/mL和16.43μg/mL。以上數據表明黑美人土豆黃酮對ABTS自由基具有清除作用，在質量濃度不高于20μg/mL時其清除作用的大小為黃酮＞VC＞蘆丁。2.4.3 黑美人土豆黃酮總抗氧化力測定

機體中有許多抗氧化物質，能使Fe3＋還原成Fe2＋，Fe2＋可與菲啉類物質形成穩定的絡合物，通過比色法測定其抗氧化力的高低，顏色越深，總抗氧化力越強[18]。黑美人土豆黃酮提取物的總抗氧化力如圖8所示，黑美人土豆的抗氧化力與其黃酮質量濃度間的相關系數為r＝0.9982；而VC和蘆丁的抗氧化力與其質量濃度間的相關系數分別為r＝0.9474和r＝0.9978，均呈線性相關。與對照VC和蘆丁相比較，在質量濃度為20μg/mL時，其總抗氧化力分別為2.94、2.82U/mL和1.42U/mL，在低質量濃度時黑美人土豆黃酮的抗氧化能力明顯高于VC和蘆丁，但當質量濃度高于20μg/mL時，VC抗氧化能力高于黑美人土豆的黃酮提取物，這個變化趨勢與對ABTS自由基清除趨勢基本一致。

圖8 黃酮、VC和蘆丁的總抗氧化力Fig.8 Total antioxidant capacity of flavonoids from “Black Beauty”potatoes, VC and rutin

3 結 論

3.1 在單因素試驗的基礎上，通過CCD組合試驗及響應面分析，得到提取黑美人土豆黃酮類化合物的最佳工藝條件：乙醇體積分數62%、溫度78℃、料液比1:35(g/mL)。在此條件下，黃酮類化合物的提取率為1.03%，與模型預測值為1.04%非常接近。說明該工藝科學合理，安全有效，在黃酮類化合物提取過程中具有很好的應用前景。3.2 抗氧化試驗表明，黑美人土豆黃酮提取物清除DPPH自由基能力優于蘆丁小于VC；而清除ABTS自由基的能力和抗氧化力在質量濃度不高于20μg/mL時大于VC，但始終大于同質量濃度的蘆丁；同質量濃度的黃酮提取物對ABTS自由基清除作用大于DPPH自由基，原因可能與提取物中黃酮的結構有關，以及提取物對不同體系的抗氧化作用不同[19]所致。黑美人土豆抗氧化的活性成分與黃酮有關外，其抗氧化還可能與醇提物中復雜的其它成分有關。至于抗氧化成分的種類、化學結構及其抗氧化機理有待進一步研究。

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Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from “Black Beauty” Potatoes

LI Cai-xia1,2，GAO Hai-ning1,2，JIAO Yang1,2，WU Dong-qing2,3，ZHANG Yong1,2,*，YANG Yan1
(1. College of Agriculture and Biotechnology, Hexi University, Zhangye 734000, China；2. Key Laboratory of Hexi Corridor Resources Utilization of Gansu Universities, Hexi University, Zhangye 734000, China；3. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hexi University, Zhangye 734000, China)

The aim of this study was to investigate optimum condition for the extraction of flavonoids and the antioxidant activity of flavonoid extract. Temperature, solid-to-liquid ratio and ethanol concentration were identified as main variables that influence extraction efficiency and their optimum conditions were determined by response surface methodology to be 78 ℃, 1:35 (g/mL) and 62%, respectively. Under these conditions, the maximum predicted extraction yield of flavonoids was in good agreement with its experimental counterpart. The DPPH radical scavenging activity of the flavonoid extract obtained was stronger than that of rutin but weaker than that of VC. However, it exhibited ABTS radical scavenging activity and total antioxidant capacity that VC at the same concentrations lower than or equal to 20 μg/mL and rutin at the same concentrations lower than or equal to 25 μg/mL. These results demonstrate that flavonoids from “Black Beauty” potatoes have potent antioxidant activity and can be used as antioxidants and in functional foods.

“Black Beauty” potato；flavonoids；extraction process；antioxidant

R284.2

A

1002-6630(2013)04-0088-06

2011-11-06

民樂縣科技局與河西學院合作項目(hxxy-ml001)；甘肅省高校研究生導師科研項目(1009-09)

李彩霞(1967—)，女，高級實驗師，學士，研究方向為天然產物開發與利用。E-mail：lipeng@hxu.edu.cn

*通信作者：張勇(1963—)，男，教授，博士，研究方向為植物學與植物分子生物學。E-mail：zhangyong@hxu.edu.cn