高效液相色譜法快速篩查與測定葡萄酒中紐甜

王 齊，朱偉偉*，楊 俊

(1.昆明理工大學分析測試研究中心，云南 昆明 650093；2.河池學院化學與生命科學系，廣西 宜州 546300)

高效液相色譜法快速篩查與測定葡萄酒中紐甜

王 齊1，朱偉偉2,*，楊 俊1

(1.昆明理工大學分析測試研究中心，云南 昆明 650093；2.河池學院化學與生命科學系，廣西 宜州 546300)

建立一種高效液相色譜法快速定性篩查與準確定量檢測葡萄酒中人工合成甜味劑紐甜的方法。采用Waters Nova-Pak C18反相色譜柱，以離子對試劑緩沖液:乙腈=60:40(V/V)為流動相，在218nm波長處，對樣品進行篩查，紐甜出峰時間約在13.4min；疑似陽性樣品在梯度洗脫條件下進行定量檢測，紐甜出峰時間約在15.9min，檢出限為0.37μg/mL，平均回收率在99%～101%之間，相對標準偏差均小于1.0%(n=5)。本方法簡便、準確、實用，在批量樣品檢測時可節省約50%的分析時間。

葡萄酒；紐甜；高效液相色譜；定性篩查；定量測定

紐甜(neotame)，化學名稱為N-[N-(3,3-二甲基丁基)-L-α-天門冬氨酰]-L-苯丙氨酸-1-甲酯，分子式為C20H30N2O5，是一種新型功能性甜味劑。紐甜的甜度約為蔗糖的8000～12000倍，為阿巴斯甜的40倍以上，甜味純正，無其他甜味劑常帶的苦味和金屬味，穩定性高，且價格相對低廉，故紐甜作為甜味調節劑廣泛用于各類食品、飲料和制造業中[1-2]。

葡萄酒是以鮮葡萄或葡萄汁為原料，經全部或部分發酵釀制而成的，含有一定酒精度的發酵酒，按其含糖量可分為干葡萄酒、半干葡萄酒、半甜葡萄酒和甜葡萄酒。近年來，大量研究發現葡萄酒因含有豐富的生物酚[3-4]，而具有抗氧化、清除自由基等功效[5-9]，從而受到消費者的青睞。葡萄酒因其產地、原料、工藝及環境的不同，使得各地出產的葡萄酒中的組成成分與口感截然不同[10-12]。葡萄酒生產商可能會添加某些甜味劑如紐甜、阿巴斯甜、安賽蜜、糖精鈉等，調節葡萄酒的甜度，達到各類葡萄酒應有的口感。然而根據GB 15037—2006《葡萄酒》中的規定[13]，所有葡萄酒中均不得添加甜味劑，因此對葡萄酒中紐甜等甜味劑進行檢測意義重大。食品和飲料中紐甜的測定方法有高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法等[14-16]，其中高效液相色譜法是最常用的測定方法。GB/T 23378—2009《食品中紐甜的測定方法》[17]中運用梯度洗脫的方法能夠較好地對復雜樣品體系中紐甜組分與干擾組分進行分離測定，但是此方法分析時間過長。因此在日常風險監測等大樣品量檢測中，急需建立一種高效、簡便、可靠的分析方法以填補葡萄酒中紐甜的測定方法空白。

本實驗擬建立一種先用等度比例色譜條件對樣品進行定性篩查，然后再用梯度比例色譜條件對陽性疑似葡萄酒樣品中紐甜含量進行測定的方法。此方法對樣品定性篩查的假陽性率小于5%，穩定性好，檢出限低，回收率高，能夠用于日常大樣品量檢測，以提高食品安全監測的工作效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紐甜標準品 美國USP公司；辛烷磺酸鈉(色譜純)美國Tedia天地試劑公司；磷酸、甲酸(均為分析純) 天津風船化學試劑有限公司；三乙胺(分析純) 天津瑞金特化學試劑有限公司；乙腈(色譜純) 江蘇漢邦科技有限公司。

1.2 儀器與設備

600四元泵、717plus自動進樣器、2487雙波長紫外檢測器、M32色譜數據處理工作站 美國Waters公司；PHS-3D型精密pH計 上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 緩沖液的配制

吸取2.5mL三乙胺溶液，溶解于1000mL蒸餾水中，用稀甲酸調節pH值至4.5。

1.3.2 離子對試劑緩沖液的配制

稱取2.00g辛烷磺酸鈉，用200mL蒸餾水溶解后，加入1.0mL磷酸溶液，定容至1000mL。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Waters Nova-Pak C18柱(150mm×3.9mm，5μm)；定性篩選色譜流動相I(isocratic)：離子對試劑緩沖液:乙腈=60:40(V/V)；定量分析流動相G(gradient)梯度比例變化見表1；流速1.0mL/min；色譜柱溫度30℃；紫外檢測器波長218nm。

表1 梯度洗脫條件Table1 Gradient elution conditions %

1.3.4 標準溶液的配制

分別準確稱取0.50、1.25、2.50、5.00mg紐甜標準品于小燒杯中，溶解后轉移至50mL容量瓶中，用pH4.5緩沖液定容至刻度，其質量濃度分別為10、25、50、100μg/mL。

1.3.5 樣品處理

準確吸取5.0mL樣液于10mL容量瓶中，加pH4.5緩沖液定容至刻度。

1.3.6 樣品的采集

市場隨機抽取50份不同產地、不同品牌半甜葡萄酒樣，按以上實驗方法進行實驗。選取3個具有代表性樣品：不含紐甜陰性樣品標記為A葡萄酒樣；經定性色譜條件分析判定為疑似陽性，定量色譜條件未檢出的假陽性樣品標記為B葡萄酒樣；經定量色譜條件檢出含有紐甜的陽性樣品標記為C葡萄酒樣。

2 結果與分析

2.1 定性篩查等度比例I色譜條件對樣品的篩查

圖1 等度比例Ⅰ色譜條件下紐甜色譜圖Fig.1 HPLC spectrum of neotame by mobile phase I

圖1為紐甜標樣、不含紐甜葡萄酒陰性樣(A)、不含紐甜葡萄酒假陽性樣(B)與含紐甜葡萄酒陽性樣(C)在等度比例I色譜條件下獲得的色譜圖。從圖1可見，紐甜標樣在等度比例I色譜條件下的保留時間為13.4min，與陽性樣(C)中紐甜組分保留時間一致；而葡萄酒假陽性樣(B)中干擾組分峰與紐甜標樣峰保留時間相近為13.2min，在不加標或其他方法驗證情況下極易判定為紐甜組分。

2.2 定量測定梯度比例G色譜條件對紐甜含量的測定

圖2 梯度比例G色譜條件下紐甜色譜圖Fig.2 HPLC spectrum of neotame by mobile phase G

圖2為紐甜標樣、不含紐甜葡萄酒假陽性樣(B)與含紐甜葡萄酒陽性樣(C)在梯度比例G條件下的色譜圖。從圖2可見，紐甜標樣在梯度比例G色譜條件下的保留時間為15.9min，與陽性樣(C)中紐甜組分保留時間一致；而葡萄酒假陽性樣(B)中干擾組分保留時間相近為14.8min，此色譜條件能夠對假陽性樣中干擾組分進行判別。

2.3 梯度比例G色譜條件定量分析方法學考察

將1.3.3節中不同質量濃度的紐甜標準溶液以梯度比例G色譜條件分別進樣10μL，結果見表2。以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線圖，標準曲線方程為Y=14258X+14397，相關系數R2=0.9998；并以2.0μg/mL紐甜標準溶液進行檢出限測定實驗，在RSN=3時計算檢出限為0.37μg/mL。

表2 紐甜標準溶液質量濃度和峰面積Table2 Correlation between neotame concentration and HPLC peak area

取10份不含紐甜的葡萄酒樣品，分別加入紐甜標準品，配制成20.0μg/mL和80.0μg/mL高、低質量濃度兩組樣品進行加標回收率實驗，結果見表3。結果表明本方法的平均回收率在99%～101%之間，相對標準偏差均小于1.0%。本法定量分析方法學結果與GB/T 23378—2009中方法學結果進行比較，回收率與精密度無明顯差異，滿足定量分析要求。

表3 紐甜回收率和精密度實驗結果Table3 Mean recovery rates and relative standard deviations for neotame in blank wine samples with spiked standard

2.4 實際葡萄酒樣品分析應用

市場隨機抽取50份不同產地、不同品牌半甜葡萄酒樣，按等度比例I色譜條件進行定性樣品快速篩查，經篩查后疑似含有紐甜的葡萄酒樣品，再經梯度比例G色譜條件進行定量分析。50份葡萄酒樣品中通過快速篩查方法發現9例樣品疑似含有紐甜，再經梯度比例G色譜條件定量分析，發現此9例樣品中2例為雜質干擾，7例樣品含有紐甜，其余41例陰性樣品不含紐甜。快速定性篩查等度比例I色譜條件的假陽性率僅為4.7%，而定性篩查等度比例I色譜條件分析時間比梯度比例G色譜條件分析時間少約20min，以風險監測一批50個樣品的葡萄酒為例，可節省約30h(雙平行測定)。

3 結 論

本實驗采用等度比例色譜條件，對葡萄酒中紐甜進行定性快速篩查，再采用梯度比例色譜條件對葡萄酒中紐甜進行定量分析。結果表明，使用定性快速篩查的方法其假陽性率小于5%，而定量測定的色譜條件方法穩定性好，檢出限低，回收率高。本實驗建立的葡萄酒中紐甜快速定性與準確定量分析的方法，能夠在批量樣品檢測中節省約50%的分析時間，既能提高食品檢驗機構工作效率，又能保證分析測試環節的工作質量。

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Fast Qualitative Analysis and Accurate Quantitative Determination of Neotame in Wine by High Performance Liquid Chromatography

WANG Qi1，ZHU Wei-wei2,*，YANG Jun1
(1. Research Center for Analysis and Measurement, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650093, China；2. Department of Chemistry and Life Science, Hechi Universtiy, Yizhou 546300, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method for fast qualitative analysis and accurately quantitative determination of artificial sweetener neotame in wine was developed. Neotame was qualitatively analyzed on a Waters Nova-Pak C18column with an ultraviolet detector at 218 nm using acetonitrile: ion-pair reagent = 40:60 (V/V) as the mobile phase, and the retention time of neotame was approximately 13.4 min. The contents of neotame in the suspected samples were determined under gradient elution condition, and the retention time of neotame was approximately 15.9 min. The detection limit of the developed method was 0.37 μg/mL, and the mean recovery rate for neotame in blank wine samples with spiked standard was 99%-101% with a relative standard deviation less than 1.0% (n = 5). This method is simple, accurate and practical, and can save 50% time during the analysis of large number of samples.

wine；neotame；high performance liquid chromatography；fast qualitative analysis；accurately quantitative determination

TS207.3

A

1002-6630(2013)04-0154-03

2012-02-06

云南省科技平臺項目(2010DH025)；昆明理工大學分析測試中心主任基金項目(2008001)；

河池學院2008年“引進人才科研啟動費”項目(2008QS-N012)

王齊(1981—)，男，工程師，碩士，研究方向為天然產物。E-mail：kmuac@163.com

*通信作者：朱偉偉(1981—)，女，講師，碩士，研究方向為藥物分析。E-mail：zhuww1230@yahoo.com.cn