電子自旋共振法和分光光度法測定釀酒葡萄籽原花青素抗氧化活性

胡博然，朱 勇，徐 潔，周 妍，賈玲玲

(1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.揚州大學生物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

電子自旋共振法和分光光度法測定釀酒葡萄籽原花青素抗氧化活性

胡博然1，朱 勇2，徐 潔1，周 妍1，賈玲玲1

(1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.揚州大學生物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

利用電子自旋共振技術(ESR)對釀酒葡萄籽原花青素4個不同提取樣品(GSP0、GSP1、GSP2、GSP3)抗氧化特性進行研究，并采用分光光度法進行對比分析。結果表明：電子自旋共振法和分光光度法均測得，GSP3樣品對DPPH自由基清除能力最強；反應30min，質量濃度小于40mg/L時，樣品質量濃度與清除率呈正相關，質量濃度大于40mg/L時，清除率趨于穩定。ESR測得的原花青素的清除率普遍高于分光光度法：反應30min，ESR測得不同質量濃度的GSP0的清除率最低為35.99%，最高為99%，而分光光度法測得分別為7.06%、78%；ESR測得的GSP3清除率最低為52.45%、最高值為99%，分光光度法測得的清除率分別是29%、95%。

電子自旋共振法；分光光度法；原花青素；DPPH

釀酒葡萄籽提取物(grape seed extract，GSE)是從釀酒葡萄的種子中提取出來的一種多酚物質的混合物，其中最主要的多酚活性物質是原花青素，其基本的單體是兒茶素和表兒茶素，這兩種單體通過聚合形成寡聚體或者多聚體，通常將2～4聚體稱為低聚體，5聚體以上的則稱為高聚體[1-3]。早在20世紀70年代，人們就對原花青素進行了大量的生化和藥理活性研究，并發現原花青素具有很強的抗氧化活性。經過幾十年的研究開發，原花青素的安全性和優越的抗氧化性已為人們所認可，在醫藥、保健食品和化妝品等方面得到了廣泛的應用[4-6]。

目前常用的檢測抗氧化性的方法有：ABTS+g法、DPPH法、ORAC法等[7-8]。其中，DPPH法在抗氧化性方面應用廣泛[9-12]。電子自旋共振技術作為一種新的檢測方法，可通過直接測定自由基信號的變化來反映清除率的大小，該方法具有及時性、直接性、靈敏性等特點，在國內檢測葡萄籽原花青素抗氧化性方面的應用很少見。

本實驗應用電子自旋共振法對實驗室提取的葡萄籽原花青素進行檢測，并采用分光光度法進行對比，研究不同純度的原花青素在不同質量濃度下對DPPH自由基的清除效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稱取1g葡萄籽粉碎后用石油醚脫脂，經微波輔助提取得到106.936mg的原花青素粗提物(crude grape seed proanthocyanidin，GSP)。稱取一定量的粗提物，經AB-8樹脂吸附，依次用25%、50%的乙醇洗脫，并將部分50%乙醇洗脫液凍干成原花青素粉末，依次把原花青素粗提物、25%乙醇洗脫液、50%乙醇洗脫液和50%乙醇洗脫液凍干粉標記為GSP0、GSP1、GSP2、GSP3，4℃冰箱保存，備用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；兒茶素標準品(MUST-11050801) 南京澤郎醫藥生物技術有限公司；無水乙醇、石油醚、香蘭素、甲醇、濃硫酸，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

A300-10/12電子順磁共振波譜儀 德國Bruker公司；UV1600-PC紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

其中:x(t)=(x1(t),x2(t),…,xN(t))T為N 維狀態向量;u(t)=(u1(t),u2(t),…,um(t))T為控制向量;mN；f(x(t),u(t),t)=(f1(x(t),u(t),t),f2(x(t),u(t),t),…,fN(x(t),u(t),t))T為N維實值函數向量.為了研究問題的方便,引入廣義狀態空間的概念.

1.3.1 釀酒葡萄籽原花青素含量測定

參照孫蕓等[13]的硫酸-香草醛法，測定原花青素含量。

1.3.2 電子順磁共振法測定DPPH自由基清除率

電子自旋共振技術(ESR)參數設置：HSC(ER4119)諧振腔，X波段頻率9.837741GHz，功率20.104mW，室溫條件，調制頻率100.0kHz，調幅2.0G，時間常數327.680ms，掃場時間665.600s，中心磁場3503.000G，掃場寬度80.00G，室溫。

以乙醇作為溶劑，將4種樣品分別配制成10、20、40、60、80mg/L不同質量濃度的溶液，取1mL待測樣品與1mL 2.5h10-4mol/mL的DPPH溶液混勻，裝入毛細管封閉好，放入ESR儀諧振腔，記錄波譜圖并計算峰面積。用95%乙醇代替樣品作為空白對照。按式(1)計算清除率[14]。

1.3.3 分光光度法測定DPPH自由基清除率

取2.5h10-4mol/mL的DPPH溶液2mL，與2mL不同質量濃度的樣品液于試管中充分混勻后，在暗處靜置30min，然后在517nm波長處測定其吸光度(Ap)，同時測定不加DPPH的樣品空白吸光度(Ac)及加DPPH但不加樣品(以95%乙醇代替樣品)的吸光度(Amax)，以VC為對照品，按(2)計算清除率。

2 結果與分析

2.1 電子順磁共振法測葡萄籽原花青素DPPH自由基清除率結果

10mg/L葡萄籽原花青素不同樣品，在進樣后0、15、30min測清除DPPH自由基效果，電子自旋共振波譜圖如圖1所示。

圖 1 10mg/L葡萄籽原花青素不同提取樣品清除DPPH自由基的電子自旋共振波譜圖Fig.1 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to different samples at a concentration of 10 mg/L

圖 2 10mg/L葡萄籽原花青素不同提取樣品對DPPH自由基的清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of different samples at a concentration of 10 mg/L

在電子順磁共振中，DPPH自由基的特征吸收強度在3460～3540G之間。由圖2可知，10mg/L葡萄籽原花青素不同樣品清除率都比較低，隨著反應時間的延長，清除率有所提高；凍干粉的清除率比洗脫液清除率高，而粗提物的清除率介于二者之間。與15min相比，在30min時GSP0、GSP1、GSP2、GSP3的清除率分別提高了35.85%、108.54%、91.14%、72.19%。

20mg/L葡萄籽原花青素不同樣品，在進樣后0、15、30min檢測清除DPPH自由基效果，電子自旋共振波譜圖如圖3所示。

圖 3 20mg/L葡萄籽原花青素不同提取樣品清除DPPH自由基的電子自旋共振波譜圖Fig.3 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to different samples at a concentration of 20 mg/L

圖 4 20mg/L葡萄籽原花青素不同提取樣品對DPPH自由基的清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging activity of different samples at a concentration of 20 mg/L

由圖4可知，20mg/L葡萄籽原花青素不同樣品清除率普遍有所提高。反應15min，與10mg/L樣品相比，GSP0清除率為37.1%，提高了40%，GSP3的清除率為44%，提高了44.45%；反應30min，GSP0清除率為52.28%，提高了45.26%，GSP3的清除率為69.66%，提高了32.81%；同一樣品兩個不同時間點的清除率對比，反應30min的GSP0的清除率比反應15min時提高了40.92%，GSP3提高了58.32%。

40mg/L葡萄籽原花青素不同樣品，在進樣后0、15、30min檢測清除DPPH自由基效果，電子自旋共振波譜圖如圖5所示。

圖 5 40mg/L葡萄籽原花青素不同提取樣品清除DPPH自由基的電子自旋共振波譜圖Fig.5 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to different samples at a concentration of 40 mg/L

圖 6 40mg/L葡萄籽原花青素不同提取樣品對DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activity of different samples at a concentration of 40 mg/L

由圖6可知，40mg/L葡萄籽原花青素不同樣品反應15min時，與20mg/L不同樣品相比， GSP0的清除率提高了61.02%，GSP3的清除率為66.57%，提高了51.3%；在反應30min時，所有樣品的清除率基本達到97%，與15min時相比，DPPH自由基已經基本被清除，且不同樣品的清除率相差不大。

60mg/L葡萄籽原花青素不同樣品，在進樣后0、15、30min檢測清除DPPH自由基效果，電子自旋共振波譜圖如圖7所示。

圖 7 60mg/L葡萄籽原花青素不同提取樣品清除DPPH自由基的電子自旋共振波譜圖Fig.7 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to different samples at a concentration of 60 mg/L

圖 8 60mg/L葡萄籽原花青素不同提取樣品對DPPH自由基的清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging activity of different samples at a concentration of 60 mg/L

由圖8可知，60mg/L葡萄籽原花青素不同樣品反應15min時，與40mg/L相比，GSP0的清除率為82.69%，提高了38.42%，而GSP3的清除率為87.9%，提高了32.04%；反應30min時，清除率基本達到98%，且不同的樣品之間相差不大。

80mg/L葡萄籽原花青素不同樣品，在進樣后0、15、30min檢測清除DPPH自由基效果，電子自旋共振波譜圖如圖9所示。

圖 9 80mg/L葡萄籽原花青素不同提取樣品清除DPPH自由基的電子自旋共振波譜圖Fig.9 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to different samples at a concentration of 80 mg/L

圖 10 80mg/L葡萄籽原花青素不同提取樣品對DPPH自由基的清除能力Fig.10 DPPH radical scavenging activity of different samples at a concentration of 80 mg/L

由圖10可知，80mg/L葡萄籽原花青素不同樣品清除率普遍較高，在反應15min時，GSP0的清除率為94.1%，略低于GSP3的95.19%，而GSP1與GSP2的清除率分別為87.64%和85.87%；在反應30min時，溶液中的DPPH自由基均基本被清除完全，并且GSP1和GSP2的清除率高達99%。

綜上所述，15min和30min時，在同一質量濃度條件下，50%乙醇洗脫液凍干粉(GSP)對DPPH自由基的清除率最高，說明葡萄籽原花青素的50%乙醇洗脫部位對自由基的清除能力強；在一定質量濃度范圍內，各原花青素提取樣品對DPPH自由基的清除能力呈現劑量效應關系，在較低質量濃度時，沒有明顯的清除能力，隨著質量濃度的升高，清除力也隨之增強。在反應15min時，GSP0的清除率高于GSP2和GSP1，可能由于反應時間短，GSP2與GSP1中的原花青素與DPPH自由基的結合未完全；在反應30 min時，GSP2和GSP1經充分反應后，清除率最終不低于GSP0。30min時，當樣品質量濃度增加至40mg/L后，提高樣品質量濃度，原花青素的清除率基本不變。這是因為在提高樣品質量濃度的初始階段，原花青素與大量的DPPH自由基相結合產生DPPH-PheO，表現為原花青素的清除率迅速提高。當樣品質量濃度繼續增大，DPPH自由基減少到一定程度時，原花青素芳香環上的羥基會與PheOg結合，從而競爭性抑制了原花青素與DPPH自由基的結合，導致樣品對DPPH自由基的清除率很難達到100%。

2.2 分光光度法測葡萄籽原花青素DPPH自由基清除率結果

圖 11 不同質量濃度的樣品對DPPH自由基的清除活性Fig.11 DPPH radical scavenging activity of different samples at different concentrations

由圖11可知，分光光度法測得的4種不同原花青素提取物均有顯著的清除率，隨著樣品質量濃度的提高其清除力也隨之增高，不同樣品對DPPH自由基清除能力的強弱次序是：GSP3＞GSP2＞GSP1＞GSP0，50%乙醇洗脫液凍干粉的清除效果最好。與ESR所測得的清除率相比較，反應30min時，相同質量濃度的同一種樣品，ESR測得的清除率明顯普遍高于分光光度法：ESR測得的GSP0清除率最低值、最高值分別是35.99%、99%，而分光光度法測得的則分別是7.06%、78%；ESR測得的GSP3清除率最低、最高值分別是52.45%、99%，分光光度法測得的分別是29%、95%。這表明ESR能更靈敏地反映原花青素對DPPH自由基的清除能力。

3 結 論

通過采用ESR和分光光度法測定4個不同釀酒葡萄籽原花青素樣品清除DPPH自由基的能力，證明葡萄籽原花青素具有很強的抗氧化能力。反應15min時，同一樣品對DPPH自由基的清除率與樣品質量濃度成正比；而反應30min時，質量濃度小于40mg/L時，樣品質量濃度與清除率呈正相關，在質量濃度大于40mg/L時，清除率趨于穩定。通過對兩種方法檢測得到的清除效果的比較，結果表明：利用ESR檢測得到的清除效果明顯好于分光光度法檢測得到的效果，ESR能更靈敏、更精確、更直觀地反映原花青素對DPPH自由基的清除效果，與分光光度法相比，它有著顯著的優越性。

本研究為葡萄籽原花青素的抗氧化性研究提供電子自旋共振波譜分析檢測方法，可在提取及含量測定方面進行更深入的研究，以期能夠為其在食品天然抗氧化劑領域的開發利用提供科學依據。

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Comparative Application of ESR and Spectrophotometry to Evaluate the Antioxidant Activity of Grape Seed Proanthocyanidins

HU Bo-ran1，ZHU Yong2，XU Jie1，ZHOU Yan1，JIA Ling-ling1
(1. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；2. College of Biological Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

Electron spin resonance (ESR) spectroscopy was used to investigate the antioxidant activity of four proanthocyanidin extracts from wine grape seeds (designated as GSP0, GSP1, GSP2 and GSP3, respectively) and compared with spectrophotometry as a control. GSP3 had the strongest DPPH radical scavenging activity as determined by both methods. After 30 min of reaction at concentrations below 40 mg/L, a positive correlation between scavenging rate and GSP3 concentration was observed. At concentrations above 40 mg/L, the DPPH radical scavenging activity of GSP3 tended to be stable. Higher scavenging rates were obtained for all four proanthocyanidin extracts using ESR than spectrophotometry. After 30 min of reaction, the DPPH radical scavenging rates of GSP0 and GSP3 at various concentrations were determined using ESR to be in the range of 35.99%ü99% and 52.45%ü99%, respectively, whereas those obtained using spectrophotometry were in the range of 7.06%ü78% and 29%ü95%, respectively.

ESR；spectrophotometry；proanthocyanidin；DPPH

TS201.2

A

1002-6630(2013)01-0033-05

2011-10-20

國家自然科學基金項目(31271857)

胡博然(1964ü)，女，教授，博士，研究方向為葡萄酒、食品生物技術與食品安全。E-mail：huboran2001@yahoo.com.cn