南瓜酒抗氧化活性及其與VC、多酚和多糖含量的關系

張靖媛，吳 昊，王鳳舞，張宏斌，王成榮,*

(1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島市農業科學研究院，山東 青島 266100)

南瓜酒抗氧化活性及其與VC、多酚和多糖含量的關系

張靖媛1，吳 昊1，王鳳舞1，張宏斌2，王成榮1,*

(1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島市農業科學研究院，山東 青島 266100)

采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH自由基)法、羥自由基(?OH)體系和超氧陰離子自由基(O2—?)體系對南瓜酒的抗氧化活性進行研究，并分析南瓜酒中VC、多酚和多糖含量與抗氧化活性之間的相關性。結果表明：南瓜酒對DPPH自由基、?OH和O2—?均具有較強的清除效果，且呈明顯的劑量效應關系，其清除效果優于相同用量條件下的南瓜提取液；同時表明VC、多酚和多糖是南瓜酒的主要抗氧化活性成分。

南瓜酒；DPPH自由基；羥自由基；超氧陰離子自由基

研究表明，果蔬中富含的多酚、VC、類胡蘿卜素及VE等抗氧化成分具有預防癌癥和心血管疾病發生、抑制由過量自由基引起的炎癥、衰老等多種疾病的生理作用[1-4]。南瓜果實富含各種維生素、礦物質、果膠、類胡蘿卜素、氨基酸、多糖和生物堿等營養成分和活性成分[5-6]，具有多種食療保健作用和藥用價值。目前，對新型南瓜精深加工產品üü南瓜酒的研究多集中在加工工藝對其品質的影響[7-9]，對其抗氧化活性的研究較少。本實驗采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基法、羥自由基(?OH)法和超氧陰離子自由基(O2—?)法對南瓜酒的抗氧化活性進行測定，為南瓜酒的進一步開發和推廣提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜為小磨盤品種，2010年11月購于青島城陽蔬菜批發市場；SY酵母(Q/YB.J02.5) 湖北安琪酵母股份有限公司；果膠酶(30000U/g) 天津利華酶制劑技術有限公司；糖化酶(80000U/g) 邢臺萬達生物工程有限公司；南瓜酒(酒精度8.0%)為自釀。

抗壞血酸(VC)、草酸、2,6-二氯酚靛酚、福林酚、碳酸鈉、濃硫酸、苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、雙氧水、鄰苯三酚、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚等均為國產分析純；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HH.S11-1型電熱恒溫水浴鍋 龍口市先科儀器公司；SL-300型榨汁機 天津市達康電器有限公司；MSZ02500正壓過濾器 上海摩速器材有限公司；MLS-3750型SANYO立式高壓滅菌鍋 日本三洋電器集團；754型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；TGL-10B高速臺式離心機、GL-20C冷凍離心機上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 南瓜提取液的制備

取新鮮南瓜10g，加入10mL 80%乙醇溶液研磨提取，10000r/min冷凍離心15min，取上清液，殘渣重復提取2次，合并上清液定容至50mL。

1.3.1.2 南瓜酒的制備

南瓜酒釀造工藝：南瓜→去皮籽→切片→熱燙→打漿→酶解→過濾→滅菌→調整→添加SO2→接種酵母菌→發酵→過濾→除菌→成品。

操作要點：按質量分數0.16%和0.30%添加果膠酶和糖化酶，50℃條件下酶解1.5h；添加蔗糖并用手持式糖度計測定糖度，將初始糖度調整為18%，殺菌后添加80mg/L的SO2，并接種已活化的酵母菌，接種量0.10%，發酵溫度25.8℃，于生化培養箱中發酵130h。

1.3.2 VC含量的測定

采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[10]進行測定。

1.3.3 多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteau法[11]進行測定，結果以沒食子酸計。

1.3.4 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[12]進行測定。

1.3.5 南瓜酒的抗氧化能力測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

參考Shimada[13]、Brandwilliams[14]等的方法并改進。將25mg/L的DPPH自由基醇溶液加入到2mL含有0.4、0.7、1.0、1.3、1.6mL樣品的水溶液中。于避光處37℃水浴30min，于517nm波長處測定吸光度。以1g/L的VC作為陽性對照。以蒸餾水作為空白對照。DPPH自由基清除率按式(1)計算。

式中：A0為空白對照在517nm波長處的吸光度；A1為樣品在517nm波長處的吸光度。

1.3.5.2 gOH清除率的測定

采用鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2體系[15-16]。取pH7.4、0.2mol/L的磷酸緩沖液4.0mL和蒸餾水16.0mL于試管中，混勻作為空白管；取4.0mL磷酸緩沖液、3.0mL鄰二氮菲(5.0mmol/L，以蒸餾水將50mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液稀釋)、2.0mL 7.5mmol/L的FeSO4和11.0mL蒸餾水于試管中，混勻作為未損傷管；取4.0mL磷酸緩沖液、3.0mL鄰二氮菲、2.0mL FeSO4、9.0mL蒸餾水和2.0mL質量分數0.1%的H2O2于試管中，混勻作損傷管；取4.0mL磷酸緩沖液、3.0mL鄰二氮菲、2.0mL FeSO4、 2.0mL H2O2和9.0mL含有0.4、0.7、1.0、1.3、1.6mL樣品的水溶液，混勻作樣品管(其中H2O2為最后添加)。將上述各組加樣搖勻后于37℃水浴60min，于510nm波長處測定吸光度。以1g/L的VC作為陽性對照。gOH清除率按式(2)計算。

式中：A樣品為樣品管在510nm波長處的吸光度；A損傷為損傷管在510nm波長處的吸光度；A未損為未損傷管在510nm波長處的吸光度。

1.3.5.3 O2—?清除率的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[17]。在試管中加入6.0mL pH8.2的Tris-HCl緩沖液，2mL含有0.4、0.7、1.0、1.3、1.6mL樣品的水溶液，(25.0f0.5)℃水浴平衡20min后，加入0.6mL 7mmol/L的鄰苯三酚準確反應3min，加入1mL 10mol/L HCl溶液終止反應，于420nm波長處測定吸光度。以1g/L的VC作為陽性對照。以蒸餾水作為空白對照。O2—?清除率按式(3)計算。

式中：A0為空白對照液的吸光度；Ai為樣品組的吸光度；Aj為樣品溶液本身的吸光度，以蒸餾水代替顯色劑的吸光度。

1.3.6 數據統計

采用Origin8.1和SPSS18.0軟件進行數據處理和統計分析。所有樣品均平行測定3次，測定結果以fs表示；相關性分析采用相關系數法，顯著性界值為P＜0.05，極顯著界值為P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 南瓜酒對DPPH自由基的清除能力

圖 1 南瓜酒對DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH radical scavenging activity of pumpkin wine

DPPH自由基是一種穩定的深紫色自由基，加入抗氧化劑后，抗氧化劑可與其反應生成無色的1,1-二苯基-2-三硝基苯胺[18]。由圖1可知，南瓜酒和南瓜提取液對DPPH自由基均具有清除作用，且在用量范圍內呈明顯的劑量效應關系。在用量為0.4～1.3mL時，南瓜酒對DPPH自由基清除率隨用量增加明顯增大，增幅為53.83%，當用量進一步增加至1.6mL時，南瓜酒對DPPH自由基清除率增幅不明顯，僅為5.10%，但超過了相同用量下VC對DPPH自由基的清除率。當用量0.4mL時，南瓜提取液對DPPH自由基清除率為9.17%，當用量為1.6mL時，清除率達到20.32%，增幅為11.15%。由此可見，南瓜酒對DPPH自由基清除效果明顯優于南瓜提取液。

2.2 南瓜酒對?OH的清除能力

OH的清除作用Fig.2 Hydroxyl radical scavenging activity of pumpkin wine圖 2 南瓜酒對?

?OH是已知活性最強的氧化劑，在很多緩沖溶液中，只要產生?OH就會與緩沖溶液反應，并且可以和所有細胞成分反應，對機體危害極大[19]。由圖2可知，在0.4～1.0mL用量范圍內，南瓜酒對?OH清除率隨用量增加明顯增大，增幅為24.87%，繼續增加用量，清除率增幅變緩，在南瓜酒用量超過0.7mL時，對?OH清除率明顯高于VC。南瓜提取液在整個實驗用量范圍內對?OH清除率呈緩慢上升趨勢，增幅均小于南瓜酒。由此可見，南瓜酒對?OH清除能力優于南瓜提取液和VC。

2.3 南瓜酒對O2—?的清除能力O2

Superoxide anion radical scavenging activity of pumpkin wine的清除作用Fig.3圖 3 南瓜酒對O-2g

—?是一種有氧激發的自由基，正常情況下，細胞內超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶類可以及時將其清除，因此對機體無有害影響。病理條件下，由于O2—?的生成過多和機體抗氧化酶類活性下降，導致體內O2—?大量積累而對細胞造成損傷[20-21]。由圖3可知，在實驗用量范圍內，南瓜酒和南瓜提取液對O2—?清除率呈劑量效應關系。當用量為0.4mL時，其清除率分別為32.62%和23.09%，用量增加到1.6mL時，清除率分別為49.40%和43.73%，前者明顯高于后者，但均未超過VC對O2—?的清除率。

鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化釋放出O2—?，并生成一系列有強烈光吸收的中間產物。由圖4的南瓜酒和南瓜提取液在O2—?清除體系中的動力學曲線可知，在3min的反應時間內，加入南瓜提取液的體系其吸光度始終高于加入南瓜酒的體系，說明加入南瓜提取液的體系中鄰苯三酚自氧化產物顏色深，O2—?濃度較高，進一步說明南瓜酒對O2—?清除能力優于南瓜提取液。

圖 4 吸光度隨時間變化的動力學曲線Fig.4 Dynamic changes in the absorbance of pumpkin wine and pumpkin extract over time

2.4 南瓜酒清除不同自由基能力的比較

圖 5 南瓜酒對3種自由基的清除效果Fig.5Comparison of scavenging activity of pumpkin wine against DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals

由圖5可知，在相同的1.0mL用量條件下，南瓜酒對DPPH自由基、?OH、?的清除率明顯不同，分別為69.68%、36.46%、46.95%，其對不同自由基清除效果依次為DPPH自由基＞?＞?OH。

2.5 南瓜酒中VC、多酚、多糖與抗氧化能力及不同抗氧化測定方法間的相關性分析

經測定，南瓜酒中VC、多酚和多糖含量分別為6.75、71.47、10.21mg/L。由表1可知，南瓜酒對DPPH自由基、?OH、O2—?的清除效果與VC、多酚和多糖含量之間存在顯著的相關性(P＜0.05)，其中南瓜酒對DPPH自由基清除效果與VC、多酚和多糖含量以及對?OH清除效果與多糖含量之間均達到極顯著水平(P＜0.01)。表明南瓜酒的抗氧化作用與其中的VC、多酚和多糖含量之間存在顯著相關性，即南瓜酒的抗氧化作用與其中所含的VC、多酚和多糖有關。為明確各成分在清除自由基時是否存在干擾，進行了偏相關性分析，由表2可知，P＞0.05，說明3種成分在清除DPPH自由基、gOH及O2—g時不存在顯著相關性，即VC、多酚和多糖清除自由基時沒有表現出增效作用。

表1 南瓜酒活性物質與抗氧化活性的相關性Table 1 Correlation between active components and radical scavenging activity of pumpkin wine

表 2 南瓜酒抗氧化活性與各活性物質的偏相關性Table 2 Partial correlation between active components and radical scavenging activity of pumpkin wine

表 3 不同抗氧化性測定方法的相關性分析Table 3 Partial Correlation among scavenging activity of pumpkinwine against DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals

由表3可知，DPPH自由基法與O2—?法分析結果具有極顯著正相關性(P＜0.01)；DPPH自由基法與?OH法分析結果、?OH法與O2—?法分析結果之間的相關系數分別為0.754和0.566，不存在統計學上的相關性(P＞0.05)。

3 討 論

抗氧化活性的研究方法分為體內實驗和體外實驗兩類，其中體外實驗簡單、快捷，應用較多。體外測定抗氧化及自由基清除能力的方法包括分光光度法、熒光法、化學發光法、色譜法、電子自旋共振法、毛細管凝膠電泳法等。由于作用機理不同，抗氧化劑在不同的體系或介質中顯示出不同的抗氧化或促氧化作用，所以對任何一種抗氧化劑的評估都與實驗體系緊密相關，單一的體系往往很難全面體現其生物學意義，需要多種體系相互補充，來研究其在不同體系的真實效應[22]。南瓜酒作為一個復雜的混合體系，評估其抗氧化活性也是如此。本實驗采用DPPH自由基法、?OH法、O2—?法對南瓜酒的抗氧化性進行綜合評價，結果表明，南瓜酒對3種自由基均表現出較強的清除效果，且清除能力明顯優于新鮮南瓜提取液，說明南瓜發酵成南瓜酒，能有效提高其抗氧化活性和功能性。

對南瓜酒中活性成分與其抗氧化能力的相關性進行分析后發現，VC、多酚和多糖與DPPH自由基、?OH和O2—?清除能力均存在顯著相關性。其中南瓜酒清除DPPH自由基和O2—?時，VC、多酚和多糖均做出了重要貢獻；清除?OH時，VC和多糖起主要作用。對其他果蔬和果蔬汁中VC和多酚與抗氧化活性之間關系的研究結果[23-25]與本實驗相一致。多酚的抗氧化性與其化學結構密切相關，其主要的活性結構包括羥基、甲基化、聚合度、糖苷化等[26]，南瓜酒中究竟是多酚的哪一種或幾種活性結構對其抗氧化活性做出了貢獻，尚需做進一步的研究。柳紅[27]對南瓜提取物多糖清除?OH和O2—?的研究得出了與本實驗一致的結果。對不同來源的多糖抗氧化活性研究時發現，多糖分子上的還原性醛羥基和羥基可使具有高度氧化性的自由基還原，阻止自由基的連鎖反應[27]，說明這2種結構是使多糖表現出抗氧化能力的重要結構。芮海云等[28]研究白芨多糖的抗氧化性時進一步證明了這一觀點，即硫酸酯化的白芨多糖能有效抑制反應體系中O2—?的產生，提示化學修飾使原來包裹在內的羥基裸露出來。

南瓜酒中除VC、多酚和多糖幾種生理活性成分含量與其抗氧化活性密切相關外，其他成分如自由氨基酸、肽類和美拉德反應產物等對其抗氧化活性是否做出了貢獻，有待于進一步的研究。

4 結論

南瓜酒對DPPH自由基、?OH、O2—?均具有較強的清除能力，且清除效果呈明顯的劑量效應關系；南瓜酒的抗氧化活性明顯優于相同用量條件下的南瓜提取液；VC、多酚和多糖是南瓜酒的主要抗氧化活性成分。

[1] SHUI G H, LEONG L P. Analysis of polyphenolic antioxidants in star fruit using liquid chromatography and mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2004, 10(22): 67-75.

[2] HUXLEY R R, NEIL H A W. The relationship between dietary fl avonol intake and coronary heart disease mortality: a meta-analysis of prospective cohort studies[J]. European Journal of Clinical Nutrition, 2003, 57(8): 904-908.

[3] KNEKT P, KUMPULAINEN J, JARVINEN R, et al. Flavonoid intake and the risk of chronic disease[J]. American Journal of ClinicalNutrition, 2002, 76(3): 560-568.

[4] PESCHEL W, SANCHEZ-RABANEDA F, DIEKMANN W, et al. An industrial approach in the search of natural antioxidants from vegetable and fruit wastes[J]. Food Chemistry, 2006, 97(1): 137-150.

[5] KOWALSKA H, LENART A, LESZCZYK D. The effect of blanching and freezing on osmotic dehydration of pumpkin[J]. Journal of Food Engineering, 2008, 86(1): 30-38.

[6] JUN H, LEE C H, SONG G S, et al. Characterization of the pectic polysaccharides from pumpkin peel[J]. Food Science and Technology, 2006, 39: 554-561.

[7] 黃儒強, 郭倩玉, 陳杰, 等. 南瓜酒發酵工藝條件的研究[J]. 食品科學, 2007, 28(8): 227-230.

[8] 王麗威, 鄭彥山, 陶敏慧, 等. 低醇南瓜汁飲料發酵工藝條件的優化[J]. 西北農業學報, 2010, 19(2): 194-197.

[9] 鄭海鵬. 南瓜酒發酵工藝及香氣成分變化研究[D]. 重慶: 西南大學, 2009.

[10] 曹建康, 姜微波, 趙玉梅. 果蔬采后生理生化實驗指導[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 2007: 34-37.

[11] SLINKARD K, SINGLETON V L. Total phenol analyses: automation and comparison with manual methods[J]. American Journal Enology and Viticulture, 1977, 28: 49-55.

[12] 嚴奉偉, 羅祖友, 吳季勤, 等. 菜籽多糖的抗氧化作用與機理研究[J].中國農業科學, 2005, 38(1): 157-162.

[13] SHIMADA K, FUJIKAWA K, YAHAR A, et al. Antioxidative properties of xanthin on autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1992, 40: 945-948.

[14] BRANDWILLIAMS W, CUVELIER M E, BERSET C. Use of a freeradical method to evaluate antioxidant activity[J]. Food Science and Technology, 1995, 28(1): 25-30.

[15] LIU Chunhui, WANG Changhai, XU Zhiliang, et al. Isolation, chemical characterization and antioxidant activities of two polysaccharides from the gel and the skin of Aloe barbadensis Miller irrigated with sea water[J]. Process Biochemistry, 2007, 42(6): 961-970.

[16] 金鳴, 蔡亞欣, 趙輝, 等. 鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+產生的羥自由基[J]. 生物化學與生物物理進展, 1996, 23(6): 553.

[17] 吳雪輝, 張喜梅, 李延群, 等. 板栗花粗提物的抗氧化活性研究[J].現代食品科技, 2008, 24(1): 14-19.

[18] SOARES A A, de SOUZA C G M, DANIEL F M, et al. Antioxidant activity and total phenolic content of Agaricus brasiliensis (Agaricus blazei Murril) in two stages of maturity[J]. Food Chemistry, 2009, 112: 775-781.

[19] 杜曉丹, 宋紀榮, 徐抗震, 等. 蘋果酒抑制自由基的研究[J]. 西北大學學報, 2006, 36(4): 578-582.

[20] GULCIN I, OKTAY M, KIRECCT E, et al. Screening of antioxidant and antimicrobial activities of anise (Pimpinella anisum L.) seed extracts[J]. Food Chemistry, 2003, 83: 371-382.

[21] 闕斐. 黃酒的抗氧化活性及其中的酚類物質[D]. 杭州: 浙江大學, 2006.

[22] 顧海峰, 李春美, 徐玉娟, 等. 柿子單寧的制備及其抗氧化活性研究[J]. 農業工程學報, 2007, 23(5): 241-245.

[23] DU Guorong, LI Mingjun, MA Fengwang, et al. Antioxidant capacity and the relationship with polyphenol and vitamin C in Actinidia fruits[J]. Food Chemistry, 2009, 113: 557-562.

[24] GARDNER P T, WHITE T A C, MCPHAIL D B, et al. The relative contributions of vitamin C, carotenoids and phenolics to the antioxidant potential of fruit juices[J]. Food Chemistry, 2000, 68: 471-474.

[25] 朱玉昌, 周大寨, 焦必寧, 等. 甜橙中不同活性成分與總抗氧化能力關系的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(5): 82-86.

[26] 王曉宇. 葡萄酒抗氧化活性及其檢測方法的研究[D]. 楊陵: 西北農林科技大學, 2008.

[27] 柳紅. 南瓜多糖的修飾、結構分析及抗氧化活性的研究[D]. 西安:陜西師范大學, 2008.

[28] 芮海云, 吳國榮, 陳景耀, 等. 白芨中性多糖抗氧化性作用的實驗研究[J]. 南京師范大學學報, 2003, 26(4): 94-98.

Correlation between Antioxidant Activity and Contents of VC, Polyphenols and Polysaccharides in Pumpkin Wine

ZHANG Jing-yuan1，WU Hao1，WANG Feng-wu1，ZHANG Hong-bin2，WANG Cheng-rong1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China；2. Qingdao Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266100, China)

The antioxidant potential of pumpkin wine was evaluated by measuring its scavenging activity against DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals and analyzed for its correlation with the contents of VC, polyphenols and polysaccharides. Pumpkin wine had strong scavenging activity against DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals in a dosedependent fashion, and its radical scavenging activity was better than that of pumpkin extract at the same dose. Meanwhile, our results suggested that VC, polyphenols and polysaccharides were the dominant antioxidant components in pumpkin wine.

pumpkin wine；DPPH radical；hydroxyl radical；superoxide anion radical

TS201.4

A

1002-6630(2013)01-0078-05

2011-11-11

山東省現代蔬菜產業技術體系

張靖媛(1987ü)，女，碩士研究生，研究方向為果樹深加工。E-mail：hollad_1@163.com

*通信作者：王成榮(1958ü)，男，教授，研究方向為果蔬深加工及貯藏。E-mail：qauwcr@126.com