嗜水氣單胞菌拮抗芽孢桿菌抗菌素相關(guān)基因分析

曹海鵬，何 珊，王會(huì)聰，呂利群,*

(1.上海海洋大學(xué)國家水生動(dòng)物病原庫，上海 201306；2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，江蘇 句容 212400)

嗜水氣單胞菌拮抗芽孢桿菌抗菌素相關(guān)基因分析

曹海鵬1，何 珊1，王會(huì)聰2，呂利群1,*

(1.上海海洋大學(xué)國家水生動(dòng)物病原庫，上海 201306；2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，江蘇 句容 212400)

分別對(duì)抗鱘源嗜水氣單胞菌的解淀粉芽孢桿菌G1的抗菌素相關(guān)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測(cè)序，并對(duì)其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列、跨膜螺旋信號(hào)、結(jié)構(gòu)域與二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析。結(jié)果表明：菌株G1僅含有伊枯草菌素合成必需基因，該基因與GenBank基因庫中芽孢桿菌屬其他細(xì)菌的伊枯草菌素A、桿菌抗霉素D、抗霉枯草菌素等伊枯草菌素家族基因自然聚類，與枯草芽孢桿菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素A基因16S rRNA序列有98%的高度同源性，而且其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與GenBank中芽孢桿菌屬其他細(xì)菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素A、脂肽類化合物Bacillorin、芽孢菌素D等抗菌物質(zhì)的氨基酸序列有高度同源性，與枯草芽孢桿菌MH25的伊枯草菌素A合成酶B(GenBank登錄號(hào)：ABY89499)的親緣關(guān)系最近。此外，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因的編碼產(chǎn)物不具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，但其結(jié)構(gòu)域中存在AMP結(jié)合位點(diǎn)和PP結(jié)合位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在α螺旋、伸展鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。

解淀粉芽孢桿菌；抗菌素相關(guān)基因；伊枯草菌素合成必需基因；系統(tǒng)發(fā)育分析

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是廣泛存在于自然界的一種非致病性細(xì)菌，能夠分泌抗生素、抗菌蛋白或多肽類物質(zhì)而對(duì)多種病原菌、真菌、有害藻類、線蟲等具有良好的抑制作用，是動(dòng)植物病害生物防治的有效武器[1-4]。然而，國內(nèi)外關(guān)于水產(chǎn)用解淀粉芽孢桿菌的研究卻鮮見報(bào)道，僅曹海鵬等[5]對(duì)抗鱘源嗜水氣單胞菌的解淀粉芽孢桿菌G1的抗菌特性、生長特性等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，而對(duì)水產(chǎn)用解淀粉芽孢桿菌功能基因、發(fā)酵工藝、應(yīng)用技術(shù)等其他方面的研究卻仍處于空白狀態(tài)。據(jù)報(bào)道，非核糖體途徑合成的伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)等脂肽類抗生素是芽孢桿菌分泌的一類主要抗菌素，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種活性[6-7]；而核糖體途徑合成的抗菌蛋白(TasA)則是另一種重要的功能蛋白，對(duì)多種動(dòng)植物病原菌具有抑制活性[8]。這些抗菌活性物質(zhì)均具有潛在的生物醫(yī)藥工程價(jià)值[9]。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究[5]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)抗鱘源嗜水氣單胞菌的解淀粉芽孢桿菌G1伊枯草菌素、表面活性素抗菌、抗菌蛋白等合成必需基因進(jìn)行了檢測(cè)與分析，以期在一定程度上確定菌株G1抗菌素相關(guān)基因分布的同時(shí)，為國內(nèi)關(guān)于水產(chǎn)用解淀粉芽孢桿菌功能基因的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

解淀粉芽孢桿菌G1(B. amyloliquefaciens strain G1)，為本實(shí)驗(yàn)室分離的鱘源致病性嗜水氣單胞菌拮抗菌株[5]。

1.2 引物設(shè)計(jì)

表 1抗菌素相關(guān)基因的擴(kuò)增引物特性Table 1 Primers used for the amplif i cation of antibiotics related genes

1.3 解淀粉芽孢桿菌抗菌素合成必需基因的PCR檢測(cè)與測(cè)序

將菌株G1接種到100mL無菌營養(yǎng)肉湯中，在200r/min、30℃條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)18～24h，然后用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細(xì)菌)提取菌株G1的基因組DNA，然后分別以基因組DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增試劑盒對(duì)抗菌蛋白合成必需基因、伊枯草菌素合成必需基因、表面活性素合成必需基因進(jìn)行PCR檢測(cè)[10]。擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積25μL，包括DNA模板2μL，引物(10pmol/L)各1μL，dNTP(每份10mmol/L) 0.5μL，dUTP 0.5μL，10hPCR buffer 2.5μL，雙蒸水17.0μL ExTaq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL。其中，抗菌蛋白合成必需基因、伊枯草菌素合成必需基因、表面活性素合成必需基因的PCR擴(kuò)增條件為：95℃、5min，94℃、60s，61℃、60s，72℃、90s，共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72℃最終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果，并將PCR產(chǎn)物通過電泳并用DNA純化回收試劑盒回收純化后，委托生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 解淀粉芽孢桿菌抗菌素合成必需基因序列比對(duì)分析

將菌株G1抗菌素合成必需基因片段的16S rRNA序列在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)中利用BLASTn軟件與GenBank中已登陸基因的16S rRNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，觀察與相關(guān)基因16S rRNA序列的相似性。

1.5 解淀粉芽孢桿菌抗菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列分析

利用DNAMAN上的Open Reading Frame Search軟件對(duì)菌株G1抗菌素合成必需基因片段編碼產(chǎn)物的16S rRNA序列進(jìn)行閱讀框分析，預(yù)測(cè)編碼的氨基酸序列，并進(jìn)一步將預(yù)測(cè)的氨基酸序列在NCBI中利用BLASTn軟件與GenBank中已登錄蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，觀察與相關(guān)蛋白氨基酸序列的相似性，并通過MEGA 4.0軟件對(duì)菌株G1抗菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與其他菌株蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析后，利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.6 解淀粉芽孢桿菌抗菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的跨膜螺旋信號(hào)分析

②提供與其他應(yīng)用程序的服務(wù)接口，照標(biāo)準(zhǔn)格式協(xié)議，將預(yù)警數(shù)據(jù)與消息數(shù)據(jù)存放于數(shù)據(jù)庫中，可供其他應(yīng)用系統(tǒng)所讀取調(diào)用。

利用米薇等[11]推薦的TMHMM 2.0在線軟件(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)菌株G1抗菌素合成必需基因片段編碼產(chǎn)物的氨基酸序列進(jìn)行跨膜螺旋信號(hào)分析。

1.7 解淀粉芽孢桿菌抗菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用Pfam軟件對(duì)菌株G1抗菌素合成必需基因片段編碼產(chǎn)物的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域及蛋白家族預(yù)測(cè)，并用SOPM軟件對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株G1抗菌素合成必需基因的PCR檢測(cè)與測(cè)序

圖 1 菌株G1抗菌素合成必需基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplif i cation of three genes essential for antibiotics synthetase of strain G1hetase essential gene of strain G1

由圖1可知，僅菌株G1的伊枯草菌素合成必需基因擴(kuò)增出一條大小為1.5kb的特異條帶，其GenBank登錄號(hào)為：JF751058，說明菌株G1含有伊枯草菌素合成必需基因，而不含抑菌蛋白合成必需基因、表面活性素合成必需基因。這與連玲麗等[10]關(guān)于拮抗芽孢桿菌EN4株和SW1株只含有伊枯草菌素合成基因的研究結(jié)果相同，但與Ramarathnam等[12]對(duì)蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)DFE4株、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)DFE16株和BS6株均含有表面活性素合成基因和伊枯草菌素A合成基因的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同，可能與菌株差異有關(guān)。

2.2 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因核苷酸序列的比對(duì)

通過NCBI網(wǎng)站上BLASTn軟件對(duì)菌株G1的伊枯草菌素合成必需基因片段16S rRNA序列與GenBank基因庫中已有菌株基因的16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較結(jié)果(表2)表明，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因與GenBank中枯草芽孢桿菌菌株的伊枯草菌素A、桿菌抗霉素D、抗霉枯草菌素等抗菌素合成相關(guān)基因自然聚類，其16S rRNA序列相似性高達(dá)81%～98%的，其中與枯草芽孢桿菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素A基因16S rRNA序列的相似性最高。這與杜志兵等[13]關(guān)于拮抗芽孢桿菌菌株的伊枯草菌素A、伊枯草菌素B、伊枯草菌素C、伊枯草菌素D、抗霉枯草菌素等脂肽合成基因核苷酸序列具有高度同源性的觀點(diǎn)相同，進(jìn)一步證實(shí)了拮抗芽孢桿菌不同菌株之間的伊枯草菌素家族脂肽合成基因具有較高的同源性。

表 2 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因與GenBank中已有細(xì)菌基因序列同源性比較Table 2 Comparison of gene sequence between the iturin synthetase essential gene of strain G1 and other related genes in GenBank

2.3 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列分析

圖 2 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1

利用DNAMAN上Open Reading Frame Search工具對(duì)菌株G1伊枯草菌素合成必需基因片段的16S rRNA序列進(jìn)行閱讀框分析，預(yù)測(cè)相應(yīng)的氨基酸序列如圖2所示，其在GenBank上的登錄號(hào)為：AEB21503。通過NCBI上BLASTn軟件對(duì)該氨基酸序列與GenBank中已登錄蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較結(jié)果表明，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與GenBank中芽孢桿菌屬其他細(xì)菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素A、脂肽類化合物Bacillorin、芽孢菌素D等抗菌物質(zhì)的氨基酸序列有高度同源性。此外，通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可以看出，菌株G1枯草菌素合成必需基因的編碼產(chǎn)物與枯草芽孢桿菌MH25的伊枯草菌素A合成酶B(GenBank登錄號(hào)：ABY89499)的親緣關(guān)系最近。這與菌株G1伊枯草菌素合成必需基因核苷酸序列比對(duì)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了菌株G1伊枯草菌素合成必需基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

圖 3 通過鄰接法構(gòu)建的基于菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on the amino acid sequence of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1 using Neighbour-Joining method

2.4 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的跨膜螺旋信號(hào)分析

表 3菌株G1枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物跨膜螺旋數(shù)據(jù)分析結(jié)果Table 3 Analysis of transmembrane heices of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1

由表3可知，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)僅為0.49898，而且前60個(gè)氨基酸殘基數(shù)為0.00033。根據(jù)跨膜蛋白判定標(biāo)準(zhǔn)[14]，即如果預(yù)測(cè)跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)大于18，預(yù)測(cè)蛋白前60個(gè)氨基酸中跨膜螺旋中的氨基酸殘基數(shù)有數(shù)個(gè)，則說明很有可能存在跨膜序列，而且蛋白N端可能存在信號(hào)肽，說明菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物不具有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，而且N端不存在信號(hào)肽。

2.5 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表 4 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析數(shù)據(jù)結(jié)果Table 4 Analysis of secondary structure of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1

由表4可知，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的氨基酸共有475個(gè)，其結(jié)構(gòu)域中存在AMP結(jié)合位點(diǎn)和PP結(jié)合位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在α螺旋、伸展鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲，其中有175個(gè)氨基酸參與形成無規(guī)卷曲，占所有氨基酸的36.84%；有155個(gè)氨基酸參與形成α螺旋，占所有氨基酸的32.63%；有107個(gè)氨基酸參與形成伸展鏈，占所有氨基酸的22.53%；僅有38個(gè)氨基酸參與形成β轉(zhuǎn)角，占所有氨基酸的8.00%。顯而易見，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)中具有相當(dāng)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)狀態(tài)的α螺旋較少，因而其形態(tài)是多變的，這與張勤奮等[15]的觀點(diǎn)相同。

3 結(jié) 論

菌株G1含有伊枯草菌素合成必需基因，該基因與枯草芽孢桿菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素A基因16S rRNA序列具有較高的相似性，其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列與GenBank中芽孢桿菌屬其他細(xì)菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素A、脂肽類化合物Bacillorin、芽孢菌素D等抗菌物質(zhì)的氨基酸序列也有高度同源性，因而推測(cè)菌株G1的抗菌作用與伊枯草菌素的產(chǎn)生有關(guān)，這與張桂英等[16]的研究結(jié)論相同。

本研究對(duì)菌株G1的伊枯草菌素合成必需基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增與測(cè)序，并對(duì)其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列、跨膜螺旋信號(hào)、結(jié)構(gòu)域與二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測(cè)與分析，填補(bǔ)了國內(nèi)關(guān)于水產(chǎn)用解淀粉芽孢桿菌功能基因研究的空白，對(duì)深入研究菌株G1伊枯草菌素生物合成機(jī)制具有重要的意義。

目前，國外已經(jīng)建立了伊枯草菌素的純化鑒定技術(shù)[17-19]，并開展了其產(chǎn)生條件的研究[20]，但我國對(duì)此卻鮮有研究。因此，將這些新技術(shù)與新成果有機(jī)地融入菌株G1伊枯草菌素的后續(xù)研究，無疑是創(chuàng)新菌株G1基礎(chǔ)與應(yīng)用研究的突破口，將極大地提高我國水產(chǎn)用拮抗芽孢桿菌的研究水平。

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Analysis of Antibiotics Related Genes from Antagonistic Bacillus amyloliquefaciens against Aeromonas hydrophila

CAO Hai-peng1，HE Shan1，WANG Hui-cong2，Lü Li-qun1,*
(1. National Collection Centre for Aquatic Pathogens, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Department of Animal Husbandry and Veterinary, Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry, Jurong 212400, China)

The antibiotics related genes of antagonistic Bacillus amyloliquefaciens G1 against Aeromonas hydrophila isolated from sturgeons were amplif i ed by PCR and sequenced. Meanwhile, the amino acid sequence, transmembrane heices, domains and secondary structure of their encoded products were determined. The results showed that only the gene essential for iturin synthetase was present in strain G1, which was naturally clustered with the iturin gene family from Bacillus sp. in GenBank, including iturin A, bacillomycin D, mycosubtilin, and showed 98% similarity to the iturin A gene sequences of B. subtilis strain MH25 and strain RB14. The amino acid sequence of the encoded product of the iturin synthetase gene exhibited high similarity to that of iturin, iturin A, bacillorin and bacillomycin D, and was close relative to the iturin A synthetase B of B. subtilis strain MH25 (GenBank accession No.ABY89499). In addition, no obvious transmembrane structure was present in the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1. However, both AMP-binding site and PP-binding site were present in its domains. Alpha helix, beta turn, random coil and extended strand were also present in its secondary structure.

Bacillus amyloliquefaciens；antibiotics related gene；iturin synthetase essential gene；phylogenetic analysis

Q939.97

A

1002-6630(2013)01-0171-04

2011-10-12

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-46-12)；國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA10A216)

曹海鵬(1981ü)，男，實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)微生態(tài)制劑與病害生態(tài)防控。E-mail：hpcao@shou.edu.cn

*通信作者：呂利群(1971ü)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物病毒分子生物學(xué)。E-mail：lqlv@shou.edu.cn