嗜水氣單胞菌拮抗芽孢桿菌抗菌素相關基因分析

曹海鵬，何 珊，王會聰，呂利群,*

(1.上海海洋大學國家水生動物病原庫，上海 201306；2.江蘇農林職業技術學院畜牧獸醫系，江蘇 句容 212400)

嗜水氣單胞菌拮抗芽孢桿菌抗菌素相關基因分析

曹海鵬1，何 珊1，王會聰2，呂利群1,*

(1.上海海洋大學國家水生動物病原庫，上海 201306；2.江蘇農林職業技術學院畜牧獸醫系，江蘇 句容 212400)

分別對抗鱘源嗜水氣單胞菌的解淀粉芽孢桿菌G1的抗菌素相關基因進行PCR擴增與測序，并對其編碼產物的氨基酸序列、跨膜螺旋信號、結構域與二級結構等進行預測與分析。結果表明：菌株G1僅含有伊枯草菌素合成必需基因，該基因與GenBank基因庫中芽孢桿菌屬其他細菌的伊枯草菌素A、桿菌抗霉素D、抗霉枯草菌素等伊枯草菌素家族基因自然聚類，與枯草芽孢桿菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素A基因16S rRNA序列有98%的高度同源性，而且其編碼產物的氨基酸序列與GenBank中芽孢桿菌屬其他細菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素A、脂肽類化合物Bacillorin、芽孢菌素D等抗菌物質的氨基酸序列有高度同源性，與枯草芽孢桿菌MH25的伊枯草菌素A合成酶B(GenBank登錄號：ABY89499)的親緣關系最近。此外，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因的編碼產物不具有明顯的跨膜結構，但其結構域中存在AMP結合位點和PP結合位點，二級結構中存在α螺旋、伸展鏈、β轉角和無規則卷曲。

解淀粉芽孢桿菌；抗菌素相關基因；伊枯草菌素合成必需基因；系統發育分析

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是廣泛存在于自然界的一種非致病性細菌，能夠分泌抗生素、抗菌蛋白或多肽類物質而對多種病原菌、真菌、有害藻類、線蟲等具有良好的抑制作用，是動植物病害生物防治的有效武器[1-4]。然而，國內外關于水產用解淀粉芽孢桿菌的研究卻鮮見報道，僅曹海鵬等[5]對抗鱘源嗜水氣單胞菌的解淀粉芽孢桿菌G1的抗菌特性、生長特性等生物學特性進行了研究，而對水產用解淀粉芽孢桿菌功能基因、發酵工藝、應用技術等其他方面的研究卻仍處于空白狀態。據報道，非核糖體途徑合成的伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)等脂肽類抗生素是芽孢桿菌分泌的一類主要抗菌素，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種活性[6-7]；而核糖體途徑合成的抗菌蛋白(TasA)則是另一種重要的功能蛋白，對多種動植物病原菌具有抑制活性[8]。這些抗菌活性物質均具有潛在的生物醫藥工程價值[9]。鑒于此，本實驗在前期研究[5]的基礎上，進一步對抗鱘源嗜水氣單胞菌的解淀粉芽孢桿菌G1伊枯草菌素、表面活性素抗菌、抗菌蛋白等合成必需基因進行了檢測與分析，以期在一定程度上確定菌株G1抗菌素相關基因分布的同時，為國內關于水產用解淀粉芽孢桿菌功能基因的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

解淀粉芽孢桿菌G1(B. amyloliquefaciens strain G1)，為本實驗室分離的鱘源致病性嗜水氣單胞菌拮抗菌株[5]。

1.2 引物設計

表 1抗菌素相關基因的擴增引物特性Table 1 Primers used for the amplif i cation of antibiotics related genes

1.3 解淀粉芽孢桿菌抗菌素合成必需基因的PCR檢測與測序

將菌株G1接種到100mL無菌營養肉湯中，在200r/min、30℃條件下搖床振蕩培養18～24h，然后用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(細菌)提取菌株G1的基因組DNA，然后分別以基因組DNA為模板，采用PCR擴增試劑盒對抗菌蛋白合成必需基因、伊枯草菌素合成必需基因、表面活性素合成必需基因進行PCR檢測[10]。擴增反應體系總體積25μL，包括DNA模板2μL，引物(10pmol/L)各1μL，dNTP(每份10mmol/L) 0.5μL，dUTP 0.5μL，10hPCR buffer 2.5μL，雙蒸水17.0μL ExTaq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL。其中，抗菌蛋白合成必需基因、伊枯草菌素合成必需基因、表面活性素合成必需基因的PCR擴增條件為：95℃、5min，94℃、60s，61℃、60s，72℃、90s，共30個循環，最后一個循環結束后，72℃最終延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統下觀察并拍照記錄結果，并將PCR產物通過電泳并用DNA純化回收試劑盒回收純化后，委托生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

1.4 解淀粉芽孢桿菌抗菌素合成必需基因序列比對分析

將菌株G1抗菌素合成必需基因片段的16S rRNA序列在美國國立生物技術信息中心(NCBI)中利用BLASTn軟件與GenBank中已登陸基因的16S rRNA序列進行同源性比對，觀察與相關基因16S rRNA序列的相似性。

1.5 解淀粉芽孢桿菌抗菌素合成必需基因編碼產物的氨基酸序列分析

利用DNAMAN上的Open Reading Frame Search軟件對菌株G1抗菌素合成必需基因片段編碼產物的16S rRNA序列進行閱讀框分析，預測編碼的氨基酸序列，并進一步將預測的氨基酸序列在NCBI中利用BLASTn軟件與GenBank中已登錄蛋白質的氨基酸序列進行同源性比對，觀察與相關蛋白氨基酸序列的相似性，并通過MEGA 4.0軟件對菌株G1抗菌素合成必需基因編碼產物的氨基酸序列與其他菌株蛋白氨基酸序列進行同源性比對分析后，利用鄰接法構建系統發育樹進行系統發育分析。

1.6 解淀粉芽孢桿菌抗菌素合成必需基因編碼產物的跨膜螺旋信號分析

②提供與其他應用程序的服務接口，照標準格式協議，將預警數據與消息數據存放于數據庫中，可供其他應用系統所讀取調用。

利用米薇等[11]推薦的TMHMM 2.0在線軟件(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對菌株G1抗菌素合成必需基因片段編碼產物的氨基酸序列進行跨膜螺旋信號分析。

1.7 解淀粉芽孢桿菌抗菌素合成必需基因編碼產物的結構域與二級結構預測

用Pfam軟件對菌株G1抗菌素合成必需基因片段編碼產物的氨基酸序列進行結構域及蛋白家族預測，并用SOPM軟件對其進行蛋白質二級結構預測。

2 結果與分析

2.1 菌株G1抗菌素合成必需基因的PCR檢測與測序

圖 1 菌株G1抗菌素合成必需基因的PCR擴增產物Fig.1 PCR amplif i cation of three genes essential for antibiotics synthetase of strain G1hetase essential gene of strain G1

由圖1可知，僅菌株G1的伊枯草菌素合成必需基因擴增出一條大小為1.5kb的特異條帶，其GenBank登錄號為：JF751058，說明菌株G1含有伊枯草菌素合成必需基因，而不含抑菌蛋白合成必需基因、表面活性素合成必需基因。這與連玲麗等[10]關于拮抗芽孢桿菌EN4株和SW1株只含有伊枯草菌素合成基因的研究結果相同，但與Ramarathnam等[12]對蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)DFE4株、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)DFE16株和BS6株均含有表面活性素合成基因和伊枯草菌素A合成基因的實驗發現不同，可能與菌株差異有關。

2.2 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因核苷酸序列的比對

通過NCBI網站上BLASTn軟件對菌株G1的伊枯草菌素合成必需基因片段16S rRNA序列與GenBank基因庫中已有菌株基因的16S rRNA序列進行同源性比較結果(表2)表明，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因與GenBank中枯草芽孢桿菌菌株的伊枯草菌素A、桿菌抗霉素D、抗霉枯草菌素等抗菌素合成相關基因自然聚類，其16S rRNA序列相似性高達81%～98%的，其中與枯草芽孢桿菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素A基因16S rRNA序列的相似性最高。這與杜志兵等[13]關于拮抗芽孢桿菌菌株的伊枯草菌素A、伊枯草菌素B、伊枯草菌素C、伊枯草菌素D、抗霉枯草菌素等脂肽合成基因核苷酸序列具有高度同源性的觀點相同，進一步證實了拮抗芽孢桿菌不同菌株之間的伊枯草菌素家族脂肽合成基因具有較高的同源性。

表 2 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因與GenBank中已有細菌基因序列同源性比較Table 2 Comparison of gene sequence between the iturin synthetase essential gene of strain G1 and other related genes in GenBank

2.3 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物的氨基酸序列分析

圖 2 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物的氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1

利用DNAMAN上Open Reading Frame Search工具對菌株G1伊枯草菌素合成必需基因片段的16S rRNA序列進行閱讀框分析，預測相應的氨基酸序列如圖2所示，其在GenBank上的登錄號為：AEB21503。通過NCBI上BLASTn軟件對該氨基酸序列與GenBank中已登錄蛋白的氨基酸序列進行同源性比較結果表明，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物的氨基酸序列與GenBank中芽孢桿菌屬其他細菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素A、脂肽類化合物Bacillorin、芽孢菌素D等抗菌物質的氨基酸序列有高度同源性。此外，通過鄰接法構建的基于菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物氨基酸序列的系統發育樹(圖3)可以看出，菌株G1枯草菌素合成必需基因的編碼產物與枯草芽孢桿菌MH25的伊枯草菌素A合成酶B(GenBank登錄號：ABY89499)的親緣關系最近。這與菌株G1伊枯草菌素合成必需基因核苷酸序列比對結果一致，進一步證實了菌株G1伊枯草菌素合成必需基因的系統進化關系。

圖 3 通過鄰接法構建的基于菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物的氨基酸序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on the amino acid sequence of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1 using Neighbour-Joining method

2.4 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物的跨膜螺旋信號分析

表 3菌株G1枯草菌素合成必需基因編碼產物跨膜螺旋數據分析結果Table 3 Analysis of transmembrane heices of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1

由表3可知，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物的跨膜螺旋中的氨基酸殘基數僅為0.49898，而且前60個氨基酸殘基數為0.00033。根據跨膜蛋白判定標準[14]，即如果預測跨膜螺旋中的氨基酸殘基數大于18，預測蛋白前60個氨基酸中跨膜螺旋中的氨基酸殘基數有數個，則說明很有可能存在跨膜序列，而且蛋白N端可能存在信號肽，說明菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物不具有明顯的跨膜結構，而且N端不存在信號肽。

2.5 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物的結構域與二級結構預測

表 4 菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物的二級結構分析數據結果Table 4 Analysis of secondary structure of the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1

由表4可知，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物的氨基酸共有475個，其結構域中存在AMP結合位點和PP結合位點，二級結構中存在α螺旋、伸展鏈、β轉角和無規卷曲，其中有175個氨基酸參與形成無規卷曲，占所有氨基酸的36.84%；有155個氨基酸參與形成α螺旋，占所有氨基酸的32.63%；有107個氨基酸參與形成伸展鏈，占所有氨基酸的22.53%；僅有38個氨基酸參與形成β轉角，占所有氨基酸的8.00%。顯而易見，菌株G1伊枯草菌素合成必需基因編碼產物的二級結構中具有相當穩定結構狀態的α螺旋較少，因而其形態是多變的，這與張勤奮等[15]的觀點相同。

3 結 論

菌株G1含有伊枯草菌素合成必需基因，該基因與枯草芽孢桿菌MH25株和RB14株的伊枯草菌素A基因16S rRNA序列具有較高的相似性，其編碼產物的氨基酸序列與GenBank中芽孢桿菌屬其他細菌的伊枯草菌素、伊枯草菌素A、脂肽類化合物Bacillorin、芽孢菌素D等抗菌物質的氨基酸序列也有高度同源性，因而推測菌株G1的抗菌作用與伊枯草菌素的產生有關，這與張桂英等[16]的研究結論相同。

本研究對菌株G1的伊枯草菌素合成必需基因進行了PCR擴增與測序，并對其編碼產物的氨基酸序列、跨膜螺旋信號、結構域與二級結構等進行了預測與分析，填補了國內關于水產用解淀粉芽孢桿菌功能基因研究的空白，對深入研究菌株G1伊枯草菌素生物合成機制具有重要的意義。

目前，國外已經建立了伊枯草菌素的純化鑒定技術[17-19]，并開展了其產生條件的研究[20]，但我國對此卻鮮有研究。因此，將這些新技術與新成果有機地融入菌株G1伊枯草菌素的后續研究，無疑是創新菌株G1基礎與應用研究的突破口，將極大地提高我國水產用拮抗芽孢桿菌的研究水平。

[1] YOSHIDA S, HIRADATE S, TSUKAMOTO T, et al. Antimicrobial activity of culture fi ltrate of Bacillus amyloliquefaciens RC-2 isolated from mulberry leaves[J]. Biological Control, 2001, 91(2): 181-187.

[2] 李超, 吳為中, 吳偉龍, 等. 解淀粉芽孢桿菌對魚腥藻的抑藻效果分析與機理探討[J]. 環境科學學報, 2011, 31(8): 1602-1608.

[3] 陳成, 崔堂兵, 于平儒. 一株抗真菌的解淀粉芽孢桿菌的鑒定及其抗菌性研究[J]. 現代食品科技, 2011, 27(1): 36-39.

[4] 車曉曦, 李校堃. 解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的研究進展[J]. 北京農業, 2010(1): 7-10.

[5] 曹海鵬, 何珊, 劉麗玲, 等. 鱘源病原性嗜水氣單胞菌拮抗芽孢桿菌的鑒定及其生物學特性[J]. 微生物學通報, 2011, 38(9): 1377-1384.

[6] KLUGE B, VATER J, SALNIKOW J, et al. Studies on the biosynthesis of surfactin, a lipopeptide antibiotic from Bacillus subtilis ATCC21332[J]. FEBS Letters, 1988, 231: 107-110.

[7] TSUGE K, AKAYAMA T, SHODA M. Cloning, sequencing and characterization of the iturin a operon[J]. Journal of Bacteriology, 2001, 183(21): 6265-6273.

[8] SERRANO M, ZILHǎO R, RICCA E, et al. A Bacillus subtilis secreted protein with a role in endospore coat assembly and function[J]. Bacteriology, 1999, 181(12): 3632-3643.

[9] 趙朋超, 王建華, 權春善, 等. 枯草芽孢桿菌抗菌肽生物合成的研究進展[J]. 中國生物工程雜志, 2010, 30(10): 108-113.

[10] 連玲麗, 謝荔巖, 林奇英, 等. 芽孢桿菌三種抗菌素基因的雜交檢測[J]. 激光生物學報, 2008, 17(1): 81-85.

[11] 米薇, 應萬濤, 蔡耘, 等. 細胞質膜蛋白質組學研究技術進展[J]. 生物技術通訊, 2008, 19(6): 900-902.

[12] RAMARATHNAM R, FERNANDO W G D. 對油菜病原真菌具有拮抗性的芽孢桿菌(Bacillus spp.)產生脂肽類抗生素及生化檢測(英文)[C] //第十二屆國際油菜大會論文集. 武漢: 第十二屆國際油菜大會籌備委員會, 2007: 22-27.

[13] 杜志兵, 丁延芹, 姚良同, 等. 枯草芽孢桿菌MH25 Iturin A操縱子的克隆與分析[J]. 生物技術通報, 2008(3): 128-132.

[14] 宋琴. 一株新型氨氮降解菌株的分離鑒定及相關功能基因的克隆[D]. 北京: 中國農業科學院, 2008.

[15] 張勤奮, 陳森雄, 蔣廉華, 等. 登革病毒GD01/98結構蛋白基因序列及蛋白二級結構初步分析[J]. 中山大學學報: 自然科學版, 2002, 41(2): 72-75.

[16] 張桂英, 廖詠梅, 張君成. 甘蔗黑穗病拮抗性芽孢桿菌的抗菌作用與伊枯草菌素A的產生有關[J]. 廣西科學, 2004, 11(3): 269-272.

[17] CHO S, LEE S, CHA B, et al. Detection and characterization of the Gloeosporium gloeosporioides growth inhibitory compound iturin A from Bacillus subtilis strain KS03[J]. FEMS Microbiology Letters, 2003, 223: 47-51.

[18] HIRADATE S, YOSHIDA S, SUGIE H, et al. Mulberry anthracnose antagonists (iturins) produced by Bacillus amyoliquefaciens RC-2[J]. Phytochemistry, 2002, 61: 693-698.

[19] YU G, SINCLAIR J, HARTMAN G, et al. Production of iturin A by Bacillus amyloliquefaciens suppressing Rhizoctonia solani[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2002, 34: 955-963.

[20] OHNO A, ANO T, SHODA M. Effect of temperature on production of lipopeptide antibiotics, iturin A and surfactin by a dual producer, Bacillus subtilis RB14, in solid-state fermentation[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1995, 80(5): 517-519.

Analysis of Antibiotics Related Genes from Antagonistic Bacillus amyloliquefaciens against Aeromonas hydrophila

CAO Hai-peng1，HE Shan1，WANG Hui-cong2，Lü Li-qun1,*
(1. National Collection Centre for Aquatic Pathogens, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Department of Animal Husbandry and Veterinary, Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry, Jurong 212400, China)

The antibiotics related genes of antagonistic Bacillus amyloliquefaciens G1 against Aeromonas hydrophila isolated from sturgeons were amplif i ed by PCR and sequenced. Meanwhile, the amino acid sequence, transmembrane heices, domains and secondary structure of their encoded products were determined. The results showed that only the gene essential for iturin synthetase was present in strain G1, which was naturally clustered with the iturin gene family from Bacillus sp. in GenBank, including iturin A, bacillomycin D, mycosubtilin, and showed 98% similarity to the iturin A gene sequences of B. subtilis strain MH25 and strain RB14. The amino acid sequence of the encoded product of the iturin synthetase gene exhibited high similarity to that of iturin, iturin A, bacillorin and bacillomycin D, and was close relative to the iturin A synthetase B of B. subtilis strain MH25 (GenBank accession No.ABY89499). In addition, no obvious transmembrane structure was present in the encoded product of the iturin synthetase gene of strain G1. However, both AMP-binding site and PP-binding site were present in its domains. Alpha helix, beta turn, random coil and extended strand were also present in its secondary structure.

Bacillus amyloliquefaciens；antibiotics related gene；iturin synthetase essential gene；phylogenetic analysis

Q939.97

A

1002-6630(2013)01-0171-04

2011-10-12

國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-46-12)；國家863計劃項目(2011AA10A216)

曹海鵬(1981ü)，男，實驗師，博士，研究方向為水產微生態制劑與病害生態防控。E-mail：hpcao@shou.edu.cn

*通信作者：呂利群(1971ü)，男，教授，博士，研究方向為水產動物病毒分子生物學。E-mail：lqlv@shou.edu.cn