對氯甲基苯甲酸鏈接的萊克多巴胺人工抗原的合成與鑒定

陳 臣，羅順菁,*，劉成梅，鄒常春，汪志宇，王文飛

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學資產(chǎn)管理處，江西 南昌 330031)

對氯甲基苯甲酸鏈接的萊克多巴胺人工抗原的合成與鑒定

陳 臣1，羅順菁1,*，劉成梅1，鄒常春2，汪志宇1，王文飛1

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學資產(chǎn)管理處，江西 南昌 330031)

采用對氯甲基苯甲酸(CBA)為鏈接臂，用混合酸酐法將萊克多巴胺(RAC)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制備人工抗原(RAC-CBA-BSA)，通過紫外、紅外、電泳鑒定抗原合成成功；再以卵清蛋白(OVA)為載體蛋白合成包被抗原(RAC-CBA-OVA)，測定其與抗體的親和力和抑制率。間接競爭ELISA結(jié)果以對CBA為鏈接臂合成的包被抗原對應的抗體滴度為7047.3、IC50為17.05ng/mL，結(jié)果表明，CBA可以用于RAC人工抗原的合成，使用RAC-CBA-OVA作為包被抗原可以提高ELISA檢測靈敏度。

萊克多巴胺；對氯甲基苯甲酸；ELISA靈敏度；人工抗原

萊克多巴胺(RAC)具有營養(yǎng)重分配，降低胴體脂肪，提高瘦肉率，同時使動物增重的作用[1-2]。但是人類過量食用(超過1.25μg/(kggd))含有該殘留的畜產(chǎn)品會引發(fā)食物中毒，表現(xiàn)為惡心、嘔吐、心悸、頭疼、目眩等[3-4]，對患有高血壓、青光眼、糖尿病等疾病的患者則可能危及生命。RAC在中國被禁止使用于飼料添加，是中國食品安全委員當前發(fā)布的第一批82種禁止在飼料、動物飲用水和畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用的藥物和物質(zhì)之一。在體育比賽中，RAC可以增強運動員、動物(如馬)肌肉，提高運動成績，國際奧委會已將其列為禁用藥物。

目前對于RAC的檢測方法主要有氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)[5-6]、高效液相色譜(HPLC)[7]以及液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)[8-9]等方法，這些方法準確、科學，但對操作者的專業(yè)要求較，儀器昂貴，且維護費用較高，不利于推廣應用。酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)是一種基于抗原抗體反應和酶化學反應的快速檢測方法，靈敏度高、特異性強、樣品前處理簡單，不需要昂貴的儀器設備，對操作人員的專業(yè)要求相對較低，非常適于現(xiàn)場監(jiān)控和大批量篩選。

RAC人工抗原是研制酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑的首要基礎，對于提高RAC檢測的靈敏度及準確性，有重要的影響。異源性ELISA檢測中，由于抗體對包被抗原的識別減弱，使得待測物能與抗體結(jié)合機會增加，與包被抗原充分競爭，從而能檢測較低濃度的待測物，提高檢測靈敏度。且免疫半抗原與包被半抗原的差異性越大，檢測靈敏度越高[10]。半抗原的結(jié)構(gòu)對ELISA檢測靈敏度的影響，從高到低依次為連接位點、鏈接臂結(jié)構(gòu)、鏈接臂長度。目前針對連接位點、鏈接臂結(jié)構(gòu)、鏈接臂長度對RAC ELISA檢測靈敏度的影響的研究未見報道。

本實驗是針對鏈接臂結(jié)構(gòu)對ELISA檢測靈敏度影響進行研究。鏈接臂的選擇首先必須考慮其結(jié)構(gòu)有利于進行蛋白質(zhì)與RAC的偶聯(lián)反應；其次根據(jù)Wright等[11]提出的理論，鏈接臂越長，產(chǎn)生高特異性抗體的可能性越低，因此鏈接臂的長度必須合適；最后要求合成抗原純化方便。對氯甲基苯甲酸(CBA)易溶于無機相，在半抗原合成中，未參加反應的CBA遇水便可析出，方便除去，而未反應的RAC也可以在隨后的透析中被除去，抗原純化方便。本實驗使用對CBA作為鏈接臂，通過混合酸酐法制備人工抗原，探索對CBA作為鏈接臂制備RAC人工抗原的方法及條件，并對其進行初步鑒定。再與以戊二酸酐為鏈接臂制備的包被抗原(RAC-SA-OVA)比較不同半抗原對ELISA檢測靈敏度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

RAC(生物純) 武漢華美公司；CBA(分析純) 強中化工有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)美國Sigma公司；N,N-二甲基酰胺(DMF)、1,4-二氧六環(huán)、三正丁胺、氯甲酸異丁酯、無水乙醇等試劑均為分析純。

320-S pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；各種規(guī)格的移液槍 芬蘭雷勃公司；磁力攪拌器 德國IKA公司；WH-3漩渦混勻議 上海滬西分析儀器廠有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器 榮華儀器設備有限公司；DU640紫外-可見分光光度計 美國Beckmen公司；蛋白質(zhì)電泳儀 美國Bio-Rad公司；MK3酶標儀、NICOLIT5700紅外光譜儀 美國熱電公司；可拆酶標板美國康寧公司；冷凍干燥機 美國Labconco公司。

1.2 方法

1.2.1 RAC人工抗原的合成

稱取34mg RAC溶于4mL DMF-1,4-二氧六環(huán)(體積比1:1)溶液中，加入20.5mg CBA，磁力攪拌室溫下反應過夜，加入10μL三正丁胺，冰浴反應10min，取出反應物至室溫，加入7μL氯甲酸異丁酯，室溫下反應2h；稱取130mg BSA、45mg OVA分別溶解于10mL DMF-PBS-蒸餾水(體積比1:1:2)中；分別取5mL BSA、OVA溶液，0℃冰浴備用，各取600μL RAC-CBA溶液以每1滴/50s的速率分別滴加至BSA、OVA溶液中，期間用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)整pH8.0左右，冰浴反應4h，反應液1000r/min離心10min，取上清4℃透析3d。冷凍干燥至粉末備用。

1.2.2 全抗原的鑒定

1.2.2.1 全抗原紅外光譜掃描

分別稱取干燥的RAC-BSA全抗原2mg和KBr 200mg放入瑪瑙缽中，在紅外燈的照射下將混合物研磨均勻后，裝入壓片模具中，在8t壓力下壓制10min，壓制成厚度為1mm的透明KBr壓片，同樣方法制備BSA和RAC的KBr壓片后，用紅外光譜儀進行掃描，得到紅外光譜圖。

1.2.2.2 全抗原紫外光譜掃描及偶聯(lián)比的計算

將RAC、BSA、OVA和兩種全抗原RAC-BSA、RAC-OVA用PBS稀釋成一定濃度的溶液，然后用DU460紫外掃描儀在波長200～400nm處進行紫外掃描，得到紫外吸光圖譜。根據(jù)公式(1)進一步計算出兩種全抗原的濃度比，即偶聯(lián)比(c1/c2)[12]。

式中：OD274nm為全抗原在RAC最大吸收波長處的光密度；OD’278nm為BSA在其最大吸收波長處的光密度；ODB274nm為BSA在RAC最大吸收波長處的光密度；OD278nm為全抗原在BSA最大吸收波長處的光密度；OD’274nm為RAC在其最大吸收波長處的光密度；ODB278nm為RAC在BSA最大吸收波長處的吸光度；c’1為RAC標準物的濃度；c’2為BSA標準物的濃度。

1.2.2.3 全抗原SDS-PAGE電泳

用蒸餾水分別稀釋RAC、BSA、OVA和兩種全抗原RAC-BSA、RAC-OVA，煮沸5min再冰浴5min，1000r/min離心5min，取上清。5%濃縮膠、16%分離膠，電極緩沖液為250mmol/L，Tris-HCl(pH8.3)，甘氨酸0.1% SDS。起始恒定電流2.1mA/cm濃縮樣品，溴酚藍進入分離膠后，將電流調(diào)制3.0mA/cm，電壓為60V，直至溴酚藍條帶距封底膠約0.5cm時停止電泳，用0.025g/mL的考馬斯亮藍(R-250)染色，用25%的甲醇和10%的冰乙酸制成脫色液脫色至背景清晰。用凝膠成像儀得到電泳圖[13]。

1.2.3 動物免疫

采用以戊二酸酐為鏈接臂制備的RAC-SA-BSA免疫原免疫小鼠制備抗血清。具體方法為：初免將人工抗原與弗氏完全佐劑1:1混合，采用皮下多點注射，免疫5周齡的雌性Balb/c小鼠；二免、三免、四免使用弗氏不完全佐劑替換弗氏完全佐劑與抗原1:1混合，同樣方法免疫Balb/c小鼠。四免后斷尾取血并用ELISA法檢測。

1.2.4 不同包被抗原對抗體親和力的影響

用間接ELISA法對比兩種包被抗原與抗體的親和力。具體如下： RAC-SA-OVA、RAC-CBA-OVA稀釋至5μg/mL包被酶標板，每孔100μL，4℃靜置過夜后用1% PBST洗滌；加入380μL 3%脫脂牛奶封閉酶標板，37℃溫育1h后洗滌；加入100μL梯度稀釋的抗體，抗體稀釋度為1:800～1:51200倍比稀釋，37℃溫育1h后洗滌；加入100μL酶標羊抗小鼠IgG，37℃溫育1h后洗滌；加入100μL TMB顯色液，37℃溫育15min；加入50μL 2mol/L的H2SO4溶液終止顯色，用酶標儀檢測其在波長450nm處OD值為陽性值。抗體滴度OD值為1.0時的抗體稀釋度。

1.2.5 不同包被抗原對ELISA檢測靈敏度的影響

用間接競爭ELISA法檢測不同包被抗原對ELISA檢測靈敏度的影響。將1.2.4節(jié)中加梯度稀釋抗體一步改為加入50μL質(zhì)量濃度為0、4、10、20、40、100、140、200ng/mL RAC標準品及50μL最佳工作質(zhì)量濃度的RAC單抗，其余步驟相同，計算抑制率(IR)。半數(shù)抑制率IC50為抑制率達到50%時的競爭品質(zhì)量濃度。

式中：OD為加入競爭品孔的OD值；OD0為競爭品質(zhì)量濃度為0孔的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 全抗原紅外光譜掃描結(jié)果

圖 1 RAC、BSA和RAC-BSA紅外掃描光譜圖Fig.1 IR spectra of RAC, BSA and RAC-BSA

如圖1所示，對比BSA和RAC-BSA人工抗原的紅外光譜圖在3500～2600cm-1和1900～1500cm-1區(qū)域出現(xiàn)了類似的吸收峰，且明顯呈現(xiàn)蛋白質(zhì)吸收特點：3297cm-1處的胺基NüH吸收峰、1666cm-1和1549cm-1的兩個酰胺譜帶[14]等，判斷應該是BSA中氨基酸產(chǎn)生的特征峰；同時，對照RAC和RAC-BSA人工抗原的紅外光譜圖發(fā)現(xiàn)它們在830cm-1附近有類似的吸收出現(xiàn)，且BSA的紅外光譜圖不具備這個特點；另外在RAC-BSA全抗原的紅外光譜圖中還能找到1000～1280cm-1處出現(xiàn)的由于RAC與BSA偶聯(lián)而產(chǎn)生的CüN伸縮振動吸收峰。綜上所述，可以得出結(jié)論在RAC-BSA的KBr壓片中含有RAC和BSA，且RAC-BSA人工抗原偶聯(lián)成功。

2.2 全抗原紫外光譜掃描結(jié)果

如圖2所示，RAC和BSA的最大吸收峰分別在波長為274nm和278nm處；而RAC-BSA全抗原的最大吸收峰在波長為276nm處，與BSA比較，波峰左移，證明人工抗原偶聯(lián)成功。同樣，RAC和OVA人工抗原的紫外光譜圖中看到相同情況，RAC-OVA全抗原的最大吸收與OVA比較同樣向左偏移，證明RAC-OVA人工抗原也偶聯(lián)成功。

圖 2 RAC、BSA和RAC-BSA紫外掃描光譜圖Fig.2 UV spectra of RAC, BSA and RAC-BSA

2.3 偶聯(lián)比的計算結(jié)果

RAC-BSA全抗原偶聯(lián)比為17.6:1；RAC-OVA全抗原的偶聯(lián)比為4.4:1。

2.4 全抗原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

圖 3 人工抗原SDS-PAGE圖Fig.3 Identif i cation of artif i cial antigens by SDS-PAGE

如圖3所示，RAC-BSA全抗原的泳動速度小于BSA，可見RAC-BSA全抗原的分子質(zhì)量大于BSA，由此可以證明RAC與BSA已經(jīng)偶聯(lián)成功，同時，RAC-BSA全抗原的條帶在其相應位置出現(xiàn)了一定程度的彌散現(xiàn)象，這是因為每一個BSA分子和RAC小分子偶聯(lián)的數(shù)目并不完全相同。使用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件分析后，得出BSA的分子質(zhì)量約66.2kD， RAC-BSA全抗原的分子質(zhì)量大約為73.5kD，全抗原中RAC與BSA的偶聯(lián)比約為18.9:1，與紫外掃描結(jié)果基本一致。OVA的結(jié)果為4.5:1，與紫外掃描結(jié)果基本相符。

2.5 抗體效價檢測結(jié)果

在包被抗原濃度等其他ELISA條件相同時，改變包被抗原種類，則其在波長450nm處的OD值反映了不同包被抗原對抗體的親和力，OD值越高，親和力越高。圖4為兩種包被抗原間接競爭ELISA法中對應的抗體稀釋曲線。相同抗體稀釋度下，RAC-SA-OVA的OD值略高于RAC-CBA-OVA，由圖計算二者的抗體滴度分別為17325.6和7047.3。由于與免疫半抗原具有不同的鏈接臂，降低了人工抗體對鏈接臂部分的識別，因此RACCBA-OVA對抗體的親和力略小于RAC-SA-OVA[15]。

提高ELISA檢測的靈敏度是優(yōu)化ELISA檢測方法的重要手段。圖5所示為間接競爭ELISA的抑制曲線，在相同抑制率下，RAC-CBA-OVA組的競爭品質(zhì)量濃度低于RAC-SA-OVA組。同時，半數(shù)抑制率IC50為判斷ELISA靈敏度的重要參數(shù)，包被RAC-CBA-OVA的ELISA檢測的IC50為17.05ng/mL低于包被RAC-SA-OVA的20.90ng/mL。由于CBA-OVA在ELISA檢測過程中與抗體結(jié)合力下降，使得抗體與RAC作用幾率增加，檢測的抑制率被提高，因此使用RAC-CBA-OVA做ELISA檢測包被抗原對檢測提高靈敏度有所幫助[16]。

圖 4 兩種包被抗原間接競爭ELISA的抗體稀釋曲線圖Fig.4 Antibody dilution curves obtained using two different coating antigens

圖 5 兩種包被抗原間接競爭ELISA的抑制曲線Fig.5 ELISA inhibition curves obtained using different coating antigens

3 討 論

食品中殘留的農(nóng)藥、抗生素及其他人為添加的有害成分的分子質(zhì)量普遍小于1kD，這些小分子物都屬于半抗原，即雖然具有抗原性，但不具備免疫原性，這是因為根據(jù)小分子半抗原與大分子載體偶聯(lián)，即人工抗原[17]。小分子物質(zhì)的免疫分析研究的關鍵在于合成出高質(zhì)量的人工抗原。BSA和OVA由于具有穩(wěn)定的理化性質(zhì)、良好的溶解性以及具有較多容易修飾的官能團，而被普遍認為是比較合適的人工抗原載體蛋白，同時，人工抗原合成之后，對其進行相應的鑒定是十分必要的，本實驗中對人工抗原的鑒定主要目的在于判斷抗原是否偶聯(lián)成功、偶聯(lián)率的計算以及人工抗原的純度鑒定。通過紅外吸收光譜法、紫外吸收光譜法、SDS-PAGE凝膠電泳對合成的人工抗原進行綜合鑒定，表明對CBA作為鏈接臂的RAC人工抗原合成成功。同時，以對CBA為間接臂合成的RAC-BSA人工抗原其偶聯(lián)比與常用的以戊二酸酐連接的人工抗原偶聯(lián)比接近，且符合Schneider等[18]提出的有關人工免疫原最適宜偶聯(lián)比應在10:1～20:1之間的要求，故可用于全抗原的合成。

根據(jù)有關包被抗原對ELISA檢測靈敏度影響的相關報道[19]，以對CBA為鏈接臂合成的RAC-OVA的偶聯(lián)比也較為適宜。同時，由于CBA和戊二酸酐在合成人工抗原時結(jié)合位點相同，而其結(jié)構(gòu)和長度并不相同，兩者對比，能直觀地反映人工抗原鏈接臂在ELISA檢測靈敏度中的影響。Kim等[10]的報道中提到，改變包被抗原鏈接臂能在一定程度上減少連接臂對ELISA檢測靈敏度的干擾，實驗結(jié)果表明，在以RAC-SA-BSA為免疫原的體系中，包被抗原RAC-CBA-OVA的親和力低于RAC-SAOVA，卻擁有更高的靈敏度，這是由于包被抗原與免疫抗原所采用的鏈接臂不同，減少了對抗體中鏈接臂部分識別的干擾，故對提高ELISA檢測靈敏性有積極作用。

[1] SHELVER W L, SIMINTH D J, BERRY E S. Production and characterization of a monoclonal antibody against the β-adrenergic agonist ractopamine[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48: 4020-4026.

[2] GABIOLA C, CALONGE M A G, PORTILLO M P, et al. Validation of a method for the determination of salbutamol in animal urine by gas chromatography-mass spectrometry and its application to treated lamb samples[J]. J Microcolumn Separations, 1996, 8: 361-364.

[3] VANOOSTHUYZE K E I, ARTS C J M, PETEGHEM C H V. Development of a fast and simple method for determination of β-agonists in urine by extraction on empore membranes and detection by a test strip immunoassay[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45: 3129-3137.

[4] SHELVER W L, SMITH D J. Determination of ractopamine in cattle and sheep urine samples using an optical biosensor analysis:comparative study with HPLC and ELISA[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51: 3751-3721.

[5] SHEN S H, OYANG J, BAEYENS W R G, et al. Determination of β-agonists by ion chromatography with direct conductivity detection[J]. J Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 38: 166-172.

[6] REGUEIRO J A G, PEREZ B, CASADMONT G. Determination of clenbuterol and salbutamol in urine by capillary gas chromatography with capillary columns of 100 μm[J]. J Chromatogr A, 1993, 655: 73-76.

[7] POLETTINIA A, MONTAGNA M, HOGENDOORN E A, et al. Applica-bility of coupled-column liquid chromatography to the analysis of β-agonists in urine by direct sample injection 1. Development of a single-residue reversed-phase liquid chromatography-UV method for clenbuterol and selection of chromatographic conditions suitable for multi-residue analysis[J]. J Chromatogr A, 1995, 695: 19-31.

[8] JOSEFSSON M, SABANOVIC A. Sample preparation on polymeric solid phase extraction sorbents for liquid chromatographic-tandem mass spectrometric analysis of human whole blood: a study on a number of beta-agonists and beta-antagonists[J]. J Chromatogr A, 2006, 1120: 1-12.

[9] SPYRIDAKI M H, VONAPARTI P K A, VALAVIANI P, et al. Doping control analysis in human urine by liquid chromatographyelectrospray ionization ion trap mass spectrometry for the Olympic Games Athens 2004: determination of corticosteroids and quantif i cation of ephedrines, salbutamol and morphine[J]. Anal Chim Acta, 2006, 573: 242-249.

[10] KIM Y J, CHO Y A, LEE H S, et al. Investigation of the effect of hapten heterology on immunoassay sensitivity and development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the organophosphorus insecticide fenthion[J]. Analytica Chimica Acta, 2003, 494(1/2): 29-40.

[11] WRIGHT A, TAO M H, KABAT E A, et al. Antibody variable region glycosylation: position effects on antigen binding and carbohydrate structure[J]. EMBO J, 1991, 10(10): 2717-2723.

[12] TIJSSEN P. Practice and theory of enzyme immunoassays[M]. New York: Elsevier Amsterdam, 1985: 27.

[13] SAMBROOK J, RUSSELL D W. Molecular cloning: a laboratory manul[M]. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002.

[14] 陳奎治, 彭亦如, 林偉, 等. 光譜分析法研究八羧酸酞菁鋁配合物與牛血清白蛋白的結(jié)合作用[J]. 光譜學與光譜分析, 2007, 27(9): 84.

[15] ZHANG Q, WANG L, AHN K C, et al. Hapten heterology for a specific and sensitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay for organophosphorus insecticide fenthion[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 596(2): 303-311.

[16] BUTLER J E. Enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Journal of Immunoassay, 2000, 21(2): 165-209.

[17] LANDSTEINER K. The specificity of serological reactions[M]. Boston: Harvard University Press, 1945: 78-86.

[18] SCHNEIDER P, HAMMOCK B D. Influence of the ELISA format and the hapten-enzyme conjugate on the sensitivity of an immunoassay for S-triazine herbicides using monoclonal antibodies[J]. Agric Food Chem, 1992, 40(3): 525-530.

[19] 羅舜菁, 鐘寒燕, 劉成梅, 等. 氯霉素免疫抗原及包被抗原的制備[J].食品科學, 2010, 31(10): 91-94.

Synthesis and Characterization of Ractopamine Antigen Linked by 4-Methylbenzoic Acid

CHEN Chen1，LUO Shun-jing1,*，LIU Cheng-mei1，ZOU Chang-chun2，WANG Zhi-yu1，WANG Wen-fei1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technolog, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Asset Management Department, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

The mixed anhydride method was used to prepare artif i cial antigen through the conjugation between ractopamine (RAC) and bovine serum albumin (BSA) in the presence of 4-chloromethyl benzoic acid (CBA). The prepared artif i cial antigen was identif i ed by IR, UV and SDS-PAGE. RAC-CBA was also conjugated with OVA to form a coating antigen. The aff i nity and inhibitory activity of the coating antigen were measured. This study suggests that CBA can be used to prepare artif i cial RAC antigens. Meanwhile, CBA conjugated with RAC to form coating agent improves the sensitivity of ELISA.

ractopamine；4-chloromethyl benzoic acid；ELISA sensitivity；artif i cial antigens

S859.84

A

1002-6630(2013)01-0180-05

2011-10-07

江西省科技支撐計劃項目(2010BNA09500)

陳臣(1982ü)，男，碩士，研究方向為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。E-mail：jordan0297@vip.sina.com

*通信作者：羅順菁(1969ü)，女，副教授，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：luoshunjing@yahoo.com.cn