產β-葡萄糖苷酶甘草內生菌的篩選及對甘草黃酮轉化的研究

張 琴，李艷賓,*，李 華

產β-葡萄糖苷酶甘草內生菌的篩選及對甘草黃酮轉化的研究

張 琴1,2，李艷賓1,2,*，李 華1

甘草黃酮類成分是甘草重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、增強心血管功能、增強免疫力等作用[1-3]，在醫藥、保健品、化妝品、食品添加劑等方面有廣泛應用。自然界中黃酮化合物多以苷類形式存在，少部分為游離苷元[4]。目前已從甘草黃酮中鑒定出150余個化合物[5]，主要藥效成分為甘草素、異甘草素、甘草苷、異甘草苷4類[6]，其中甘草苷、異甘草苷是甘草素與異甘草素的酚羥基被葡萄糖以β-葡萄糖苷鍵聯接而成的糖苷型。

酚羥基是黃酮發揮作用的主要功能基團，其一旦成苷，往往造成生物活性的降低甚至喪失[7-8]。且苷元的酚羥基被葡萄糖取代后，極性增大脂溶性降低，從而影響到藥效強度及藥代動力學過程，導致生物利用度下降，人體吸收慢，不能很好發揮藥效[9-12]。針對黃酮糖苷和苷元的轉化，多采用醚化、酯化、?；然瘜W衍生反應水解黃酮糖苷來生產苷元。但化學反應過程易使苷類物質結構發生改變，水解產物復雜，且反應過程易屏蔽掉酚羥基，降低黃酮抗氧化活性[13]。微生物在生長過程中能產生豐富的酶系，通過微生物酶的催化作用，能使某些中藥的化學成分發生結構變化。微生物轉化法在沙棘黃酮、大豆異黃酮、苜蓿黃酮等方面已有較多研究[12,14-15]，但對甘草黃酮卻鮮有報道。

植物內生菌是指定殖在健康植物體內并與植物建立和諧關系的一類微生物，內生菌不僅能夠參與植物次生成分的合成，還可對植物次生代謝產物進行轉化[16-17]。有學者對甘草內生菌開展了相關研究，結果表明甘草中也有著數量較多的內生菌[17-18]，但目前研究多集中在對甘草內生菌資源的調查方面，而對其是否可作為甘草有效成分微生物轉化的菌種篩選源未見報道。為此本研究在分離與甘草生物相容性好的內生菌的基礎上，從中篩選高產β-葡萄糖苷酶微生物菌種，以期實現黃酮糖苷的有效轉化。同時結合本課題組前期初步探索出的微生物發酵處理從甘草渣中提取黃酮的工藝[19-20]，以期為后期建立甘草渣中黃酮的微生物同步提取與轉化提供菌種材料與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草為新疆阿拉爾市附近野生脹果甘草(Glaycyrrhiza inf l аte Bat.)，于2009年5ü8月在不同生長點采集。

甘草素、甘草苷、異甘草素、異甘草苷標準品(純度＞98%)，購自安徽蕪湖甙爾塔醫藥科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

EQ-200粉碎機 武義縣屺立工具有限公司；GZX-9140MBE數顯鼓風干燥箱、PX-9272MBE數顯電熱培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；AR1140精密電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SHZB金怡水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市醫療儀器廠；LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司；721可見分光光度計 上海箐華科技有限公司。

1.3 培養基

1.3.1 分離培養基

內生細菌的分離采用牛肉膏蛋白胨培養基；內生真菌的分離用PDA培養基；內生放線菌的培養基選用高氏1號。

1.3.2 發酵培養基

細菌培養基：CMC-Na 10g、蛋白胨10g、KH2PO42g、NaCl 2g、MgSO4g7H2O 0.04g、水1000mL，pH 7.0。

真菌及放線菌培養基：CMC-Na 10g、(NH4)2SO42g、KH2PO42g、NaAc 1g、CaCl20.5g、MgSO4g7H2O 0.2g、ZnCl20.02g、FeSO40.01g、CoCl20.017g、水1000mL，pH 5.6。

1.4 方法

1.4.1 甘草內生菌的分離與純化

采集到的新鮮甘草植株洗凈，將根、莖、葉分開并裝入燒杯中，用2.5g/100mL的NaClO分別將根、莖浸泡5min、葉浸泡2min，無菌水沖洗3次后再用75%乙醇分別浸泡5min和1min，再用無菌水沖洗3～4次，最后1次清洗的水涂布至牛肉膏蛋白胨培養基平板中檢查表面消毒效果。

經表面消毒的甘草根莖葉分別用無菌粉碎機粉碎，取少量均勻撒在分離培養基上，細菌28℃、真菌與放線菌30℃條件下培養箱中培養。每天進行觀察，菌體長出后根據菌落及菌體形態以劃線法分別轉接至相應的培養基上進行純化，最終得到純培養菌株。

1.4.2 產β-葡萄糖苷酶內生菌的篩選

1.4.2.1 產酶發酵條件

1.4.2.2 β-葡萄糖苷酶活性測定

將發酵液在4500r/min離心15min，取上清酶液0.4mL，加入1.2mL 0.1mol/L的磷酸檸檬酸緩沖液(pH 5.0)、0.4mL 8mmol/L對硝基苯酚β-葡萄糖苷溶液充分混合，在45℃水浴鍋中反應30min后加入2mL 0.5mol/L Na2CO3溶液終止反應，在400nm波長處測定吸光度[21]。以對硝基苯酚為標準對照品，配制不同濃度的標準溶液，各取2mL加入NaCO3溶液顯色后測定吸光度。以吸光度為橫坐標，對硝基苯酚濃度(μmol/L)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：y = 108.8x – 1.9629(R2= 0.9992)。

1.4.3 β-葡萄糖苷酶高產菌株產酶動力學測定

根據各菌株β-葡萄糖苷酶活測定結果，篩選出GF10、GF19兩株高酶活真菌。配制真菌發酵培養基進行發酵，方法和培養條件同上，5次重復。從第2天起每天測定酶活力，連續測定10d，方法同前。

1.4.4 甘草黃酮微生物轉化及抗氧化測定

1.4.4.1 發酵粗酶液的制備

按GF10、GF19兩株菌的最佳產酶周期進行發酵，發酵結束后6000r/min離心15min，并用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，既得粗酶液。每種菌重復3次，以未接菌培養基作空白對照。

調查歷代碑志文獻及歷代字書材料，我們發現“岡”既是“罔”的俗字，作為構件時，又是“岡”的俗寫。以“罔”“岡”為構件的字常出現同形相混現象，結果造成其俗訛字的對應關系異常復雜，難以準確分辨。因此，我們有必要徹底理清“罔”和“岡”演變過程，搞清楚同形字“岡”或構件“岡”形成的原因及時間，總結其演變規律，以便為相關俗字辨析、漢字發展史研究和文獻整理提供切實參考。

1.4.4.2 甘草黃酮底物溶液的制備

[19]用80%乙醇從甘草渣中提取黃酮，在65℃條件下減壓蒸餾除去乙醇并定容，再經0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即得酶解底物。測得黃酮質量濃度為0.135mg/mL。

1.4.4.3 甘草黃酮的轉化及抗氧化測定

將黃酮底物與粗酶液按體積比為3:1的比例在40℃水浴中酶解30min，結束后反應液進行DPPH自由基抗氧化實驗，以未經轉化的黃酮溶液為對照。

DPPH抗氧化實驗參考文獻[22]，采用分光光度測定法。DPPH用70%的乙醇配制成6.5h10-5mol/L的溶液，取4mL DPPH乙醇溶液，加入0.8mL待測液，搖勻，室溫下反應15min，在517nm波長處測定吸光度，記作Ai；取4mL 70%乙醇溶液，加入0.8mL待測液，反應后測定吸光度，記作Aj；取4mL DPPH溶液，加入0.8mL蒸餾水，反應后測定吸光度，記作A0。DPPH自由基清除率按下式計算。

1.4.4.4 轉化產物組成成分分析

采用HPLC法檢測轉化前后黃酮溶液中甘草苷、甘草素、異甘草苷及異甘草素4種成分的含量。儀器設備為：Waters Alliance HPLC 2695；色譜條件為：色譜柱SinoChrom ODS-BP 5μm，柱溫25℃，柱壓3100psi，流速1mL/min，檢測波長260nm。采用混合標液進樣，以甲醇-水為流動相梯度洗脫，程序如表1所示。

表 1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradual elution program for HPLC separation

標準曲線制備：用甲醇分別配制甘草苷、甘草素、異甘草苷、異甘草素溶液，再取適量進行混合，制備成不同濃度梯度的混合標準液，分別取10μL進樣測定(其中甘草苷、異甘草苷質量濃度分別為2、5、10、15、20μg/L，甘草素、異甘草素質量濃度分別為1、2.5、5、7.5、10μg/L)，得回歸方程和相關系數。甘草苷：Y=10100X–3880(R2=0.9987)；異甘草苷：Y=7060X–3710(R2=0.9986)；甘草素：Y=17400X–4080(R2=0.9984)；異甘草素：Y=14656X–3774.8(R2=0.9984)。

2 結果與分析

2.1 甘草內生菌的分離

從甘草根莖葉中共分離出47株甘草內生菌，根據菌落形態及顯微鏡觀察結果，可分為內生真菌22株(GF1～GF22)，內生細菌12株(GB1～GB12)，內生放線菌13株(GA1～GA13)，結果見表2。不同甘草組織中內生菌的分布密度不同，其中根中的內生真菌有12株，占真菌總數的54.55%；其次為莖，分離到8株內生真菌，占36.36%；葉中最少，分離到2株內生真菌。內生放線菌也以莖和根中較多，分離到的菌株數分別占到46.15%和38.46%，葉中內生放線菌較少。內生細菌的數量則以葉中最多，分離到5株，占細菌總數的41.67%，根中相對最少。

表 2 甘草不同部位內生菌的分離結果Table 2 Results of endophyte isolation from different parts of Glycyrrhiza inf l ate

2.2 甘草內生菌產β-葡萄糖苷酶菌株的篩選

對分離所得47株甘草內生菌進行了β-葡萄糖苷酶活力測定。結果發現，多數內生菌都能產β-葡萄糖苷酶，細菌、放線菌的酶活普遍較低，而甘草內生真菌的產酶能力普遍較好，其中GF10和GF19兩株真菌酶活力分別高達18.63、18.04U，顯著高于其余菌株，兩株菌均分離自甘草根中。經廣東微生物所鑒定兩株菌分別為泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和構巢曲霉(Emericella nidulans)，選擇此兩株高產β-葡萄糖苷酶菌株進行后續實驗。

2.3 β-葡萄糖苷酶高產菌株產酶動力學的測定

圖 1 GF10(A)和GF19(B)的β-葡萄糖苷酶產酶動力學曲線Fig.1β-Glucosidase production kinetics of GF10 and GF19

由圖1可知，GF10在發酵8d內，酶活力總體呈增大趨勢，在第8天時達到最高，此后酶活力開始下降，所以初步確定GF10的最佳發酵時間為8d。GF19在第4天達到產酶高峰，此后酶活稍有降低并趨于平穩，因此選擇4d為其最佳發酵時間。

2.4 β-葡萄糖苷酶高產菌株酶轉化對甘草黃酮抗氧化活性的影響

圖 2 GF10、GF19產酶轉化甘草黃酮對DPPH自由基的清除率比較Fig.2 DPPH radical scavenging rates of fl avonoids before and after transformation

由圖2可知，經β-葡萄糖苷酶轉化之后的黃酮溶液對DPPH自由基的清除率均有顯著增加(P＜0.01)，GF10、GF19兩株菌轉化后黃酮的DPPH自由基清除率分別為71.67%、65.94%，比未經轉化黃酮對照的清除率(20.68%)分別提高了246.57%、218.86%?？梢姡ㄟ^β-葡萄糖苷酶的轉化，能夠有效提高甘草黃酮的抗氧化活性。

2.5 β-葡萄糖苷酶轉化前后甘草黃酮檢測的主要組成成分

表 3 轉化前后黃酮溶液中甘草苷、甘草素、異甘草苷及異甘草素的含量(x±s,n＝3)Table 3 Concentrations of liquiritin, isoliquiritin, liquiritigenin and isoliquiritigenin before and after transformation (x±s,n＝3)

由表3可知，相對于未經轉化的對照，經微生物酶轉化后的處理中甘草苷與異甘草苷的含量均有不同程度的降低，其中甘草苷下降的程度達到極顯著水平(P＜0.01)，同時甘草素和異甘草素的含量增加極顯著(P＜0.01)。其中，菌株GF19轉化處理中的甘草素所占的比例最高，為29.18%，比轉化前的(10.38%)提高了181.12%；異甘草素比例最高的是GF10處理，為8.64%，比轉化前(4.27%)提高了102.34%。

3 結 論

在天然活性物質利用的過程中，往往通過理化或生物方法有意識地將其中的低效成分轉化為高效成分。黃酮糖苷轉化為苷元的途徑主要有化學法及生物法，其中生物轉化法備受關注，它是在溫和的條件下發生作用，能克服化學反應的缺點，減少產物分解、異構、消旋和重排反應等不利因素，增加目標產物產量。生物轉化法又主要有酶解轉化與微生物轉化兩類，酶的專一性強，水解效率高，反應條件溫和，得到的苷元產品穩定，因此被廣泛用于黃酮苷元的水解制備[23-24]。微生物在生長過程中可產生多種酶類，且很多為分泌型胞外酶，這些種類豐富而活性顯著的酶系可將黃酮糖苷分解轉化為苷元。與酶解轉化相比，微生物轉化省去了酶分離純化的環節，可以有效節省成本，且微生物產生的是復合酶系，可保證水解反應是在各種酶有機組合的條件下進行的，這比單一酶或簡單幾種酶組合的水解效率要高。相比較而言，微生物轉化法更具應用前景，也因此成為近年來許多學者研究的熱點之一[9,12,15]。

在黃酮苷類的微生物轉化工藝中，轉化菌種的選擇十分關鍵。植物體內有著種類、功能均十分豐富的內生菌，本研究從甘草根莖葉中分離得到數量較多的內生細菌、真菌和放線菌，并從中篩選得到高產β-葡萄糖苷酶真菌2株，對甘草黃酮的轉化結果表明，黃酮糖苷得到有效水解，苷元含量顯著增加，抗氧化活性顯著增強，證實甘草黃酮能利用微生物轉化法進行結構轉化，甘草內生菌可作為轉化菌種的有效篩選源。與自然界中其他微生物相比，由于長期進化的關系，內生菌與寄主植物具有很好的生物相容性，不會受到寄主體內代謝產物的抑制，所以選用內生菌進行黃酮結構轉化更能保證反應高效進行。由于目前甘草黃酮的提取源主要是甘草渣，結合甘草渣中黃酮的微生物法提取工藝[19-20]，下一步將開展分離提取菌種與轉化菌種同步發酵的工藝研究。

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(1.塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學 新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

對甘草內生菌進行分離，并從中進行高產β-葡萄糖苷酶菌株的篩選，以利用微生物轉化法將甘草黃酮糖苷水解成苷元，提高其抗氧化活性。結果從分離純化出的47株甘草內生菌中篩選得到GF10和GF19兩株高β-葡萄糖苷酶活性真菌，兩株菌對甘草黃酮的轉化實驗結果表明：轉化后黃酮的抗氧化活性均有顯著增加，GF10、GF19對DPPH自由基的清除率分別達到71.67%、65.94%，比未經轉化黃酮的清除率(20.68%)分別提高了246.57%、218.86%。對甘草黃酮主要成分的HPLC法檢測結果表明，經微生物轉化后，甘草苷與異甘草苷的質量濃度均有不同程度的降低，而甘草素和異甘草素的質量濃度則顯著增加。其中GF19轉化的處理，甘草素在4種黃酮物質中所占的比例最高，為29.18%，比轉化前(10.38%)提高了181.12%；異甘草素比例最高的處理是GF10，為8.64%，比轉化前(4.27%)高出102.34%。

甘草；內生菌；β-葡萄糖苷酶；甘草黃酮；轉化

Isolation of β-Glucosidase-Producing Endophytes from Glycyrrhizа inf l аte and Their Effects on Flavonoid Transformation

ZHANG Qin1,2，LI Yan-bin1,2,*，LI Hua1
(1. College of Life Science, Tarim University, Alar 843300, China；2. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Tarim University, Alar 843300, China)

Forty-seven endophytes were isolated from different parts (root, stem and leaf) of Glycyrrhiza inflate and potent 2 β-glucosidase-producing strains, designated as GF10 and GF19, were screened out of them. GF10 and GF19 were comparatively evaluated for their effectiveness in microbial transformation of flavonoid glucosides in Glycyrrhiza inflate into aglycones to obtain higher antioxidant activity. Both strains could increase the antioxidant activity of fl avonoids, and the DPPH radical scavenging rates after fermentation with them were 71.67% and 65.94%, respectively, which were 246.57% and 218.86% higher than before fermentation (20.68%). HPLC analysis showed that the concentrations of liquiritin and isoliquiritin decreased to different extents after microbial transformation, whereas the concentrations of liquiritigenin and isoliquiritigenin signif i cantly increased. Liquiritigenin was the most abundant among four fl avonoids with a percentage of 29.18% after GF19 transformation, which was 181.12% higher than the original level (10.38%), while GF10 transformation made isoliquiritigenin the most dominant fl avonoid and its percentage was increased from its original level (4.27%) to 8.64% by 102.34%.

licorice；endophytes；β-glucosidase；licorice fl avonoids；transformation

TS201.1；Q939.9

A

1002-6630(2013)01-0194-05

2011-10-19

新疆兵團青年科技創新資金專項(2010JC38)；新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室開放課題(BR0804)

張琴(1980ü)，女，講師，碩士，研究方向為微生物轉化。E-mail：jhtabszq@163.com

*通信作者：李艷賓(1983ü)，男，講師，碩士，研究方向為微生物發酵。E-mail：ydhant@163.com