交聯草酸脫羧酶聚集體的制備及其性質

梁 躍，林日輝,*，黃文勤，秦 夢，李香香，何美卿，鄭元博

(1.廣西民族大學化學化工學院，化學與生物轉化過程新技術廣西高校重點實驗室，廣西 南寧 530006；2.南寧奕德環境科技有限公司，廣西 南寧 530003；3.東北大學理學院，遼寧 沈陽 110819)

交聯草酸脫羧酶聚集體的制備及其性質

梁 躍1，林日輝1,*，黃文勤2，秦 夢1，李香香1，何美卿1，鄭元博3

(1.廣西民族大學化學化工學院，化學與生物轉化過程新技術廣西高校重點實驗室，廣西 南寧 530006；2.南寧奕德環境科技有限公司，廣西 南寧 530003；3.東北大學理學院，遼寧 沈陽 110819)

為了獲得緩解泌尿系統草酸鹽結石病癥的酶制劑，用無載體固定化方法üü交聯酶聚集體(CLEAs)制備交聯草酸脫羧酶聚集體。使用基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK誘導表達制備草酸脫羧酶粗酶液，用30%的乙醇進行沉淀分離提純，純化倍數為2.7倍，酶活回收率91.2%；在戊二醛添加量為0.06%、pH5、牛血清白蛋白添加量0.5g/L、4℃的條件下處理該酶2h，得到交聯草酸脫羧酶聚集體(oxdc-CLEAs)，酶活回收率達95.4%；酶學性質研究表明，相對游離草酸脫羧酶，交聯草酸脫羧酶聚集體的耐酸性、耐熱性、耐胰蛋白酶降解能力均有提高。

草酸脫羧酶；交聯酶聚集體(CLEAs)；制備；性質

草酸(HOOCüCOOH)是自然界中酸性最強的有機二元酸，它以草酸鹽的形式廣泛的存在于植物、微生物和包括人在內的動物體內[1]。人體內沒有降解草酸鹽的相關酶，人們食用一些高草酸含量的食物后容易的造成草酸在人體內的積累，進而引發多種病理狀態，如尿結石、腎結石、高草酸尿、低血鈣癥、VB6缺乏等[2-3]，對結石主要成分的分析表明，80%為難溶的草酸鈣[3]。在西方國家中，12%的人患有結石相關的疾病，而且泌尿系統結石病人經排石治療后易復發，在中國復發率高達60%～80%[4]。目前對草酸水平升高的治療方法都不是非常有效，主要通過限制草酸的攝入量來預防結石，而且許多原發性的高草酸尿患者需要密集的透析和器官移植，這大大增加了患者的痛苦和經濟壓力，因此需要尋求一種安全的從體內去除草酸鹽的方法。通過服用某種酶制劑降解攝入體內的草酸鹽，是緩解泌尿系統草酸鹽結石病癥，降低患者痛苦的有效方法[5]。

草酸脫羧酶(EC 4.1.1.2)是一種含錳的金屬酶，它可以催化草酸脫羧為甲酸和CO2，是植物、微生物中草酸代謝降解的主要催化酶之一[6]。它主要來源于木材腐朽真菌，尤其是白腐菌，在動物中只有天竺鼠的肝臟中有發現該酶[7]。草酸脫羧酶在醫療、食品、工業生產和生物監測等領域都有非常大的應用潛力[8-9]。目前已有交聯酶晶體法(CLECs)制成草酸脫羧酶酶制劑用于治療草酸鹽結石癥的報道[10]，但交聯草酸脫羧酶晶體(oxdc-CLECs)的制備必須首先經過酶分子的結晶，所需的酶純化程度和結晶條件都很高，操作困難，費用較高。2000年，荷蘭Delft大學的Sheldon小組提出了交聯酶聚集體(CLEAs)的固定化酶技術，該方法經過聚集和交聯兩個過程，聚集過程并沒有造成蛋白質的失活[11-12]。與交聯酶晶體法固定化技術相比，交聯酶聚集體(CLEAs)方法具有對酶的純化度要求不高、操作簡單、成本低廉、設備簡單、單位體積活性大、空間效率高的優點[11,13]。本實驗對Bacillus subtilis來源的草酸脫羧酶進行誘導表達，制取草酸脫羧酶粗酶液，研究交聯草酸脫羧酶聚集體(oxdc-CLEAs)制備的最適條件，并對交聯草酸脫羧酶的性質進行研究，為草酸脫羧酶進一步的開發應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK 本實驗室保存。

LB培養基組成(g/L)：培養基含蛋白胨 10、酵母提取物5、氯化鈉10g，pH7.0。LB固體培養基添加18g瓊脂粉。

1.2 試劑與儀器

草酸鉀、甲酸脫氫酶 美國Sigma公司；氨芐青霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD)、牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶生工生物工程(上海)有限公司；無水乙醇、丙酮、戊二醛、甲酸鈉、硫酸銨、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、MnCl2均為國產分析純。

TU-1901紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器；CR-22G高速冷凍離心機 日本日立公司； 1-13高速臺式離心機 美國Sigma公司；超低溫冰箱 美國Beckman公司；冰箱 中國海爾公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝公司；KJMR-Ⅳ血液混勻器、HH-2數顯恒溫水浴鍋 國華電器公司。

1.3 方法

1.3.1 草酸脫羧酶的誘導表達

[14]方法，發酵培養基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK，加入0.4mmol/L IPTG誘導表達草酸脫羧酶，收獲菌體以50mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液提取獲得粗酶液。

1.3.2 草酸脫羧酶的純化

草酸脫羧酶粗酶液分別加入不同添加量的硫酸銨，無水乙醇和丙酮，4℃冰箱中過夜沉淀，10000r/min離心5min，收集沉淀，用50mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液重新溶解，分析酶活力回收及純化效果。

1.3.3 草酸脫羧酶聚集體的制備與交聯

取純化酶液加入適量沉淀劑，4℃冰箱沉淀過夜，得到草酸脫羧酶聚集體懸浮液。添加戊二醛溶液至一定添加量，置于血液混合器進行振蕩反應，10000r/min離心5min，棄上清液，用50mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液沖洗沉淀數次，獲得交聯草酸脫羧酶聚集體，4℃保存待用。

1.3.4 游離草酸脫羧酶和交聯草酸脫羧酶聚集體的活性測定

草酸脫羧酶活力測定采用終止反應法[15]。反應液含76mmol/L草酸鉀，50mmol/L pH 4.0 檸檬酸緩沖液，37℃水浴2min，加入草酸脫羧酶液開始反應，10min后加入等體積的0.2mol/L磷酸氫二鉀使體系pH值上升至中性終止反應。反應液加入輔酶NAD以及甲酸脫氫酶，分光光度法檢測分析，計算甲酸的量。酶活力單位定義為：每分鐘催化轉化草酸產生1μmol甲酸的酶量。

蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定，以BSA作為標準品。

1.3.5 交聯草酸脫羧酶聚集體的制備與條件優化

在不同戊二醛添加量、交聯pH值、交聯時間、BSA添加量條件下，比較制備交聯草酸脫羧酶聚集體的酶活回收率，以初始草酸脫羧酶酶活力為100%。

1.3.6 游離草酸脫羧酶與交聯草酸脫羧酶聚集體的性質

1.3.6.1 最適pH值

在pH2.5～7.0的不同檸檬酸緩沖液反應體系中分別測定酶活力，以酶活力最高數據為100%，計算相對酶活力，觀察pH值對游離酶和交聯酶聚集體活性的影響。

1.3.6.2 最適反應溫度

反應檸檬酸緩沖液pH 4.0，在不同溫度條件下分別測定酶活力，以酶活力最高數據為100%，計算不同溫度條件下的相對酶活力，觀察游離酶和交聯酶聚集體反應的最適溫度。

1.3.6.3 耐熱性

游離酶與交聯酶聚集體在不同溫度條件下熱處理30min后測殘余酶活力，以初始酶活力為100%，觀察處理后酶活力的變化。將游離酶和交聯酶聚集體置于65℃水浴，每30min取樣檢測殘余酶活力，以初始時間的酶活力為100%。

1.3.6.4 對胰蛋白酶的耐受性

分別取4.5mL游離酶和交聯酶聚集體，加入2.5g/L的胰蛋白酶溶液0.5mL，37℃水浴，定時取樣檢測剩余酶活力，以原始活性數據為100%酶活力，觀察游離酶和交聯酶聚集體對抗胰蛋白酶消化的能力。

2 結果與分析

2.1 草酸脫羧酶的表達

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK經IPTG誘導及超聲破碎細胞提取后得到草酸脫羧酶粗酶液，酶活力為7.078U/mL，蛋白含量為1.12mg/mL，酶比活力為6.315U/mg。

2.2 草酸脫羧酶的分離純化

圖 1 沉淀草酸脫羧酶SDS-PAGE結果Fig.1 SDS-PAGE of crude enzyme solution and different solvent precipitates

用不同質量分數的硫酸銨、丙酮和乙醇對草酸脫羧酶進行沉淀分離，重溶沉淀SDS-PAGE結果如圖1所示。草酸脫羧酶易于被實驗所用3種沉淀劑沉淀釋出，但丙酮和乙醇對草酸脫羧酶沉淀的選擇性優于硫酸銨。其中，使用30%乙醇分離純化草酸脫羧酶效果良好，可去除粗酶液中66.2%的蛋白，酶活回收率達91.2%，純化倍數為2.7倍，比30%丙酮純化倍數提高了17.4%，因此后續實驗選擇30%乙醇做為沉淀劑。

2.3 交聯草酸脫羧酶聚集體的制備與條件優化

2.3.1 酶聚集體的制備

取適量純化酶液于2mL離心管緩慢滴加無水乙醇至乙醇體積分數30%，4℃冰箱沉淀過夜得到草酸脫羧酶聚集體懸浮液。

2.3.2 交聯劑添加量的確定

圖 2 戊二醛添加量對交聯反應的影響Fig.2 Effect of glutaraldehyde concentration on activity recovery

由圖2可知，當戊二醛添加量低于0.06%，交聯酶聚集體活力回收隨戊二醛添加量的增加而增加，但當戊二醛添加量到達0.06%之后，酶活回收率隨戊二醛添加量的增加而顯著降低。推測是由于戊二醛添加量過高時，會造成一定的空間范圍內酶分子的交聯過于緊密，產生空間位阻而影響酶的活性[16]，而且過高添加量戊二醛對酶分子的變性失活也是影響因素之一，因此0.06%的戊二醛是進行交聯反應的適宜添加量。

2.3.3 交聯反應pH值的確定

圖 3 不同交聯pH值對交聯反應的影響Fig.3 Effect of cross-linking pH on activity recovery

由圖3可知，在磷酸鹽緩沖液pH5條件下獲得交聯酶聚集體的酶活回收率最高。這是由于草酸脫羧酶的等電點在5附近[17]，在此pH值條件下草酸脫羧酶聚集體沉淀較完全，經交聯反應后酶活回收率也較高，因此選擇交聯反應pH值為5。

2.3.4 交聯時間的確定

圖 4 不同交聯時間對交聯反應的影響Fig.4 Effect of cross-linking time on activity recovery

由圖4可知，在2h反應時間內，交聯酶聚集體的酶活回收率隨著交聯時間的增加而增加，2h后，隨著時間的延長，酶活回收率反而不斷下降，該結果與董曉毅等[18]在制備交聯脲酶聚集體研究相似，可見，交聯反應過度反而會降低交聯酶聚集體的酶活回收率，因此確定2h為適宜的交聯反應時間。

陶行知先生說：“先生的責任不在教，而在教學，而在教學生學。”在“學為中心”的課堂中，教師要設法將如何“教”的預設，轉化成學生的“學”的引導，以極大地激發學生的學習興趣。

2.3.5 添加BSA對交聯效果的影響

圖 5 BSA添加量對交聯反應的影響Fig.5 Effect of BSA concentration on activity recovery

Shah等[19]研究表明，對于酶蛋白濃度較低或戊二醛對酶活力影響比較大的酶，在制備交聯酶聚集體的反應中加入適量的BSA，可以顯著提高交聯酶聚集體的酶活回收率。由圖5可知，添加到終質量濃度為0.5g/L的效果最佳，過量添加BSA可能會影響酶活性中心與底物的接觸，而降低交聯草酸脫羧酶聚集體活性。

2.4 游離酶與交聯酶聚集體的性質比較

圖 6 游離草酸脫羧酶與交聯草酸脫羧酶聚集體的最適pH值Fig.6 Optimal reaction pH for oxdc-CLEAs and free oxdc

2.4.1 交聯酶聚集體的最適反應pH值由圖6可知，交聯草酸脫羧酶聚集體的反應pH值范圍比游離草酸脫羧酶寬泛，在pH2.5時交聯草酸脫羧酶聚集體還有80%的相對酶活力，而游離草酸脫羧酶只剩10%不到，這與潘延芳等[20]在交聯重組枯草桿菌纖溶酶聚集體的制備及其性質研究中的結果相似，說明交聯聚集后的酶對酸性環境耐受能力更強。

2.4.2 交聯酶聚集體的最適反應溫度

圖 7 游離草酸脫羧酶與交聯草酸脫羧酶聚集體的最適反應溫度Fig.7 Optimal reaction temperature for oxdc-CLEAs and free oxdc

由圖7可知，游離草酸脫羧酶和交聯草酸脫羧酶聚集體的最適反應溫度均在47℃左右。

2.4.3 交聯酶聚集體的耐熱性

分別在45、50、55、60、65、70、75℃條件下處理游離草酸脫羧酶與交聯草酸脫羧酶聚集體30min，檢測殘余酶活力，結果如圖8所示，交聯草酸脫羧酶聚集體比游離草酸脫羧酶更耐熱。在實驗條件下，游離草酸脫羧酶的變性失活溫度低于65℃，交聯草酸脫羧酶聚集體的變性失活溫度高于70℃；其中，在75℃處理30min，游離草酸脫羧酶的殘余酶活力僅為13.4%，而交聯草酸脫羧酶聚集體的殘余酶活力高達77.1%。將游離草酸脫羧酶與交聯酶聚集體分別置于65℃水浴，每隔30min測酶活力，結果如圖9所示。3.5h內，交聯草酸脫羧酶聚集體酶活力基本無損失，游離草酸脫羧酶在65℃溫浴酶活逐漸發生變性失活，半衰期t1/2為2h。推測是由于酶交聯后分子質量變大，剛性增強進而可以耐受較高的溫度。此結論與交聯脲酶優良的耐熱性有相似之處[18]。

圖 8 游離草酸脫羧酶與交聯草酸脫羧酶聚集體的耐熱性Fig.8 Heat tolerance of free oxdc and oxdc-CLEAs

圖 9 65℃游離草酸脫羧酶與交聯草酸脫羧酶聚集體的熱穩定性Fig.9 Thermal stability of free oxdc and oxdc-CLEAs at 65 ℃

圖 10 游離草酸脫羧酶與交聯草酸脫羧酶聚集體對胰蛋白酶的耐受性Fig.10 Tripsin resistance of free oxdc and oxdc-CLEAs

由圖10可知，交聯草酸脫羧酶聚集體對胰蛋白酶消化的耐受能力顯著高于游離草酸脫羧酶，其中，使用胰蛋白酶處理48h后，交聯草酸脫羧酶殘余酶活力大于80%，而游離草酸脫羧酶殘余酶活力低于50%。這是由于交聯草酸脫羧酶具有相對有序的蛋白質三維結構，大分子的蛋白水解酶被排斥在外而降低了它對酶的水解作用。交聯草酸脫羧酶聚集體要做成酶制劑藥物作用于人體內就必須能夠通過胃酸屏障并對胃腸道內的蛋白水解酶如胰蛋白酶等有一定耐受性，使其藥效不至于損失過快。實驗結果表明，通過制備交聯酶聚集體，可體提高草酸脫羧酶抵抗胰蛋白酶消化的能力，適用于開發藥用酶制劑。

3 結 論

草酸鹽在人體內的積累是形成泌尿系統結石的主要因素，現有的治療草酸鹽升高的方法如食用高劑量藥物，調節飲食和透析等僅僅是部分或暫時有效的，而且它們還可能產生不利的副作用，因此需要一種安全的從人體去除草酸鹽的方法。草酸脫羧酶是一種極具開發潛力的酶，它可以高效專一的分解草酸鹽生成無害的甲酸。為了探索利用草酸脫羧酶制成酶制劑以緩解泌尿系統結石病患者的痛苦，國外已有學者對高純度的草酸脫羧酶進行結晶處理并進行交聯固定制成CLECs酶制劑，此種方法需要高純度的酶和結晶處理，操作難度大，制作成本高。為了降低獲得草酸脫羧酶酶制劑的成本，本實驗研究了無載體固定化方法制備交聯草酸脫羧酶聚集體的方法，用30%乙醇對草酸脫羧酶粗酶液進行沉淀分離，操作簡單，費用低廉，純化效果好；用0.06%戊二醛添加量在pH5的磷酸鹽緩沖液中添加0.5g/L的BSA交聯2h得到交聯草酸脫羧酶聚集體，酶活回收率達95.4%。對其性質進一步研究表明交聯草酸脫羧酶聚集體的耐酸性、耐熱性、對胰蛋白酶的耐受性均比游離草酸脫羧酶穩定。本研究為草酸脫羧酶作為預防、治療結石的酶制劑的開發應用提供一定的參考。

CLEAs技術是一種新的無載體技術，它不需要純度較高的酶就能用于交聯，操作簡便，在一般實驗室就能完成，而且成本低廉，不需要復雜的酶純化結晶處理，是一種非常有前景的固定化技術，本研究考察了用草酸脫羧酶粗酶液經一步沉淀分離后進行無載體交聯固定化的方法，為交聯酶聚集體技術的進一步運用提供了理論依據。

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Preparation and Properties of Cross-Linked Oxalate Decarboxylase Aggregates

LIANG Yue1，LIN Ri-hui1,*，HUANG Wen-qin2，QIN Meng1，LI Xiang-xiang1，HE Mei-qing1，ZHENG Yuan-bo3
(1. Key Laboratory of New Techniques for Chemical and Biological Conversion Process, College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China；2. Nanning Yide Environment Technology Co. Ltd., Nanning 530003, China；3. College of Sciences, Northeastern University, Shenyang 110819, China)

Cross-linked oxalate decarboxylase aggregates (oxdc-CLEAs) for use as an enzyme preparation to relieve urinary oxalate stone disease were prepared by a carrier-free immobilization method. Crude enzyme solution was obtained from the induced expression of the genetically engineered strain E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK, and oxalate decarboxylase was separated by adding 30% ethanol with a purification factor of 2.7 and an activity recovery of 91.2%. Cross-linked oxdc-CLEAs were further obtained after 2 h of cold treatment at 4 ℃ in the presence of 0.5 g/L bovine serum albumin (BSA) and 0.06% glutaraldehyde at pH 5, resulting in an activity recovery of 95.4%. Enzymatic characterization showed that cross-linked oxdc-CLEAs had improved tolerance to acid, heat and trypsin degradation when compared to free oxalate decarboxylase.

oxalate decarboxylase；cross-linked enzyme aggregates；preparation；properties

Q814.4

A

1002-6630(2013)01-0215-05

2011-11-11

廣西化工過程創新技術研發平臺建設項目(桂科能0992028-13)；廣西自然科學基金項目(2011GXNSFC018015)

梁躍(1985ü)，男，碩士研究生，主要從事化學與生物轉化研究。E-mail：lyyue1013@126.com.cn

*通信作者：林日輝(1972ü)，男，副教授，博士，主要從事發酵工程、酶工程研究。E-mail：linrihui_0@yahoo.com.cn