酶解山核桃蛋白制備降血壓肽的工藝

包怡紅，于陽陽，趙若詩

(東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

酶解山核桃蛋白制備降血壓肽的工藝

包怡紅，于陽陽，趙若詩

(東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

采用堿性蛋白酶對山核桃蛋白進行水解，以水解度和水解物的ACE抑制率為考察指標，考察酶解pH值、酶解溫度、酶解時間、加酶量4個因素的影響，并在此基礎上通過響應面組合優化試驗，確定得到ACE抑制率最佳的條件為酶解pH8.2、酶解溫度56℃、酶解時間4h、加酶量5880U/g(以底物計)，此時水解度為29.03%，水解物的ACE抑制率可達到72.48%。

山核桃蛋白；降血壓肽；水解度；ACE抑制率；響應面

高血壓是最常見的慢性心血管疾病之一，可造成大腦、心血管、腎臟的損害，是導致腦卒中、心力衰竭和冠心病等疾病的重要因素。高血壓的主要治療方法之一是通過降低人體內血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)的活性，從而可防止由于ACE活性高導致的心肌收縮加強、血管平滑肌收縮、血壓升高[1-2]。雖然市場上治療高血壓的藥物已經較為多樣成熟，但是由于這些藥物在代謝過程中可能會產生毒副作用，所以，近年來國內外科學家從天然食物中研制出降壓肽üü利用酶制劑在溫和條件下水解蛋白質，而獲得的一類可以降低高血壓人群體內ACE活性的多肽。研究人員已經利用酶法、微生物發酵法、基因工程法等方法從牛乳蛋白、大豆、谷物、玉米、膠原蛋白、大蒜、酒糟、米糠、油菜籽、藻類、魚貝類、海蜇等食物源中研制出了降血壓肽[3-8]。

目前未見對水解山核桃蛋白制備降血壓肽的報道，本實驗利用堿性蛋白酶水解實驗室自制山核桃蛋白，通過單因素和響應面試驗組合確定制備山核桃降血壓肽的最佳酶解條件，為山核桃降血壓肽的理論研究和進一步的產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山核桃蛋白為采用堿提酸沉法自制。

甘氨酸、茚三酮、果糖、Na2HPO4g10H2O、KH2PO、乙醇、NaCl、硼砂、硼酸、NaOH均為國產分析純；血管緊張素轉化酶(0.25UN)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL) 美國Sigma公司；堿性蛋白酶Alcalase(食品級) 丹麥諾維信公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；TU-1800PC紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；PB-10標準型酸度計 上海精密儀器儀表有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器 常州國華電氣有限公司；旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山核桃蛋白的酶解

將自制山核桃蛋白凍干樣品配制為2%的蛋白溶液，分別在加酶量(以底物計)3000、4000、5000、6000、7000U/g，酶解溫度為30、40、50、60、70℃，酶解時間為1、2、3、4、5、6h，酶解pH值為7、8、9、10、11、12的不同條件下進行酶解[9-11]。酶解過程中用磁力攪拌器進行攪拌，同時滴加0.1mol/L NaOH維持相應pH值條件。酶解后以100℃沸水浴滅酶15min。將酶解液離心4000r/min，10min，取上清液進行水解度和ACE抑制率測定。

1.3.2 山核桃蛋白酶解制備降血壓肽的響應面組合試驗

在酶解單因素試驗的基礎上，以酶解pH值、酶解溫度、酶解時間、加酶量為影響因素，以ACE抑制率作為考察指標，進行優化試驗，采用Box-Behnken和SAS9.0進行試驗設計和結果分析，得出制備降血壓肽的最佳工藝。試驗設計見表1。

表 1 響應面試驗因素和水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.3 水解度的測定

采用茚三酮方法[12-13]測定山核桃蛋白水解度。取水解蛋白液0.50mL定容至50mL，取0.40mL稀釋液于試管中并加入1.60mL蒸餾水、1.00mL顯色劑，混勻后置沸水浴中加熱15min，同時作空白實驗。以后操作同標準曲線。利用標準曲線計算水解蛋白液中üNH2的含量(μmol/mL)。

式中：Ah為不同時間水解液中的總游離üNH2含量/(μmol/mL)；A0為原料蛋白中固有的游離üNH2含量/ (μmol/mL)；A總為原料蛋白強酸水解后的總游離üNH2含量/(μmol/mL)。

1.3.4 原料蛋白完全水解液的制備

準確稱取0.10g原料山核桃蛋白粉于水解管中，加入6mol/L的鹽酸20mL，于100℃回流反應24h，水解反應后，旋轉蒸發除去鹽酸，干涸后用蒸餾水溶解，并定容至100mL。同樣采用茚三酮方法測定完全水解中總游離üNH2數。

1.3.5 水解液ACE抑制率的測定

在Cushman[14]、Chiang[15]等所用的方法的基礎上從對ACE抑制率測定方法進行改進。方法如下：將HHL溶解在0.1mol/L、pH8.3的硼酸緩沖液(含有0.3mol/L NaCl)中配成0.005mol/L的HHL溶液，取100μL該溶液于5mL的離心管中，反應管中加入40μL酶解物，在37℃恒溫水浴 3～5min，再加入10μL ACE酶液啟動反應，恒溫反應60min。對照管中先入40μL硼酸緩沖液代替酶解物，反應結束后均加入 150μL 1mol/L鹽酸終止反應。然后在反應管中加入40μL硼酸緩沖液，對照管中加入40μL酶解物。空白組為在反應前先加入150μL 1mol/L HCl以終止反應外，其余操作與反應管完全相同。最后加入1.0mL乙酸乙酯，振蕩混合，4000r/min離心10min后，取出750μL酯層移入試管中，在100℃的烘箱中烘干(約30min)，再加入3mL的去離子水溶解的馬尿酸，漩渦混合30s，在228nm波長處測定吸光度(A)。

式中：Ab是ACE與HHL完全反應后生成物吸光度；Aa是ACE與抑制劑(酶解物)反應被抑制，又與HHL同時反應后生成物吸光度；Ac是ACE失活后，再加抑制劑，是ACE與HHL反應的空白吸光度。

2 結果與分析

2.1 酶解單因素試驗

2.1.1 酶解pH值對水解度和ACE抑制率的影響

圖 1 pH值對水解度和ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of pH on degree of hydrolysis and ACE inhibitory rate

在酶解時間3h、加酶量5000U/g、酶解溫度50℃的條件下，考察酶解pH值對水解度和ACE抑制率的影響。結果如圖1所示。當酶解pH值增加至8時，山核桃蛋白溶液的水解度為25.78%，酶解物的ACE抑制率為61.14%，均達到最大值，隨著pH值的增加，水解度和ACE抑制率均減小，說明較高pH值環境可能導致堿性蛋白酶的失活，不適于水解。pH值的變化導致的水解度和ACE抑制率的變化較為明顯。

2.1.2 酶解溫度對水解度和ACE抑制率的影響

在酶解pH8、酶解時間3h、加酶量5000U/g的條件下，考察酶解溫度對水解度和ACE抑制率的影響，結果如圖2所示。當酶解溫度由30℃逐漸增加時，山核桃蛋白溶液的水解度和酶解物的ACE抑制率也隨之增加，溫度40～60℃時，水解度變化不很明顯，在50℃時水解度最大為25.38%；而對于酶解物ACE抑制率來說，溫度在40～60℃范圍變化時，ACE抑制率變化明顯，當溫度為50℃時，酶解物ACE抑制率達到最大為59.88%。綜合考慮水解度和酶解物ACE抑制率2個因素，50℃酶解效果較好。

圖 2 酶解溫度對水解度和ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of temperature on degree of hydrolysis and ACE inhibitory rate

2.1.3 酶解時間對水解度和ACE抑制率的影響

圖 3 酶解時間對水解度和ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis and ACE inhibitory rate

在酶解pH8、酶解溫度50℃、加酶量5000U/g的條件下，考察酶解時間對水解度和ACE抑制率的影響。結果如圖3所示。酶解時間從1h逐漸增加時，山核桃蛋白溶液的水解度和酶解物的ACE抑制率也隨之增加。當時間增加至4h后，水解度增加不明顯，在4.5h水解度達到最大為27.61%；而酶解4h時，酶解物的ACE抑制率可達62.38%，隨著酶解時間的延長，ACE抑制率有降低趨勢。

2.1.4 加酶量對水解度和ACE抑制率的影響

在酶解pH8、酶解溫度50℃、酶解時間4h條件下，考察加酶量對水解度和ACE抑制率的影響。結果如圖4所示。當加酶量逐漸增加時，山核桃蛋白溶液的水解度和酶解物的ACE抑制率均隨之增加，當增加至5000U/g時，水解度的增加不再明顯，此時為26.25%，酶解物的ACE抑制率也達到最大為60.34%。

圖 4 加酶量對水解度和ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis and ACE inhibitory rate

2.2 山核桃蛋白酶解制備降血壓肽工藝的優化

2.2.1 模型建立與方差分析

根據單因素的試驗結果，采用四因素三水平對蛋白質水解度和酶解物的ACE抑制率進行響應面優化，按照表1進行試驗。結果見表2。

表 2 響應面試驗設計方案及分析結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表 3 回歸分析結果Table 3 Results of regression analysis

表 4 ACE抑制率的試驗結果方差分析表Table 4 Analysis of variance for the fi tted regression model for ACE inhibitory rate

根據以上結果進行回歸分析見表3，由表分析可知試驗選用的模型對于水解度和ACE抑制率具有高度的顯著性(P＜0.0001)。從表4可知，在以ACE抑制率為響應值的模型中，A、B、C、D、AB、AD、CD、A2、B2、C2這些因素對ACE抑制率的影響顯著，即酶解pH值、酶解溫度、酶解時間、加酶量、酶解pH值和酶解溫度的交互作用、pH值和加酶量的交互作用、酶解時間和加酶量的交互作用這些都對水解物的ACE抑制率有顯著的影響。

2.2.2 響應面分析與優化

利用SAS9.0軟件進行處理分析得到回歸方程如下：以水解度為響應值，得方程為：

Y=—695.792282 + 65.816293A +10.781166B + 45.63432C +0.014908D—4.388031A2+0.098005AB—0.119953B2+ 0.2725AC+0.55256BC—9.847373C2+ 0.000232AD—0.000023755BD+0.000758CD—0.000001693D2(R2=0.9756)

由方程預測得到最佳水解度的條件為pH8.422、酶解溫度57.653℃、酶解時間4.264h、加酶量5530.169U/g，此條件得到的最佳水解度為30.652%。以ACE抑制率為響應值，得方程為：

Y=—2175.32875+196.024167A + 30.393667B + 185.498333C + 0.0751433D—8.995A2— 0.4245AB—0.21985B2—0.985AC—0.355BC—14.495C2—0.00343AD—0.000118BD—0.00748CD—0.00000093D2(R2=0.9717)

由方程分析預測得到最佳ACE抑制率的條件為pH8.227、酶解溫度56.482℃、酶解時間3.919h、加酶量5882.808U/g，此條件得到的最佳ACE抑制率為73.939%。根據分析結果和實際條件確定得到ACE抑制率最佳的條件為pH8.2、酶解溫度56℃、酶解時間4h、加酶量5880U/g，經驗證得到該條件水解物的ACE抑制率為72.48%，與預測值接近，此時水解度為29.03%。

通過上述ACE抑制率模型的二次多項回歸方程所作的響應曲面圖及其等高線圖見圖5～7，分別是pH值與酶解溫度(AB)、pH值與加酶量(AD)、酶解溫度與加酶量(BD)交互作用對水解物ACE抑制率的影響。響應曲面坡度相對陡峭，表明響應值對于處理條件的改變非常敏感。等高線的形狀反映出交互作用的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反[16]。根據圖可知這幾個因素的交互作用對水解物ACE抑制率的影響是顯著的，與表4結果一致。

圖 5 酶解pH值與酶解溫度交互影響水解物ACE抑制率的響應曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of hydrolysis pH and temperature on ACE inhibitory rate

圖 6 酶解pH值與加酶量交互影響水解物ACE抑制率的響應曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of hydrolysis pH and enzyme dosage on ACE inhibitory rate

圖 7 酶解溫度與加酶量交互影響水解物ACE抑制率的響應曲面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the effects of hydrolysis temperature and enzyme dosage on ACE inhibitory rate

3 結 論

通過單因素試驗考察酶解pH值、酶解溫度、酶解時間、加酶量4個因素，并在此基礎上利用響應面試驗優化酶解制備山核桃降血壓肽的工藝。確定得到ACE抑制率最佳的條件為pH8.2、酶解溫度56℃、酶解時間4h、加酶量5880U/g，此時水解度為29.03%，水解物的ACE抑制率為72.48%。本實驗為山核桃降血壓肽的酶法制備提供理論依據，并為其進一步開發利用奠定基礎。

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Enzymatic Preparation of Antihypertensive Peptides from Juglans mandshurica Maxim Protein

BAO Yi-hong，YU Yang-yang，ZHAO Ruo-shi
(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

In this study, Juglans mandshurica Maxim protein, prepared in our laboratory using alkaline extraction and acid precipitation, was hydrolyzed with alcalase to prepare antihypertensive peptides. Operating parameters such as pH, temperature, hydrolysis time and enzyme dosage were optimized using response surface analysis based on degree of hydrolysis and ACE inhibitory rate. The optimum hydrolysis conditions for maximum ACE inhibitory rate (72.48%) were found to be hydrolysis at 56 ℃ and pH 8.2 for 4 h with an enzyme/substrate ratio of 5880 U/g. Under these conditions, the degree of hydrolysis was 29.03%.

Juglans mandshurica Maxim protein；antihypertensive peptide；degree of hydrolysis；ACE inhibitory activity；response surface methodology

TS201.1；TS218

A

1002-6630(2013)01-0220-05

2011-11-06

東北林業大學中央高校基金項目(DL09CA14)

包怡紅(1970ü)，女，教授，博士，研究方向為天然產物生物轉化、功能性食品。E-mail：baoyihong@163.com