鯉魚肽的酶法制備工藝及其抗氧化性

馬井喜，孫永杰，馮 印，閔偉紅*

(1.吉林農業大學發展學院生物食品學院，吉林 長春 130600；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

鯉魚肽的酶法制備工藝及其抗氧化性

馬井喜1，孫永杰1，馮 印1，閔偉紅2,*

(1.吉林農業大學發展學院生物食品學院，吉林 長春 130600；2.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118)

以鯉魚肉為原料，采用酶解技術制備鯉魚抗氧化肽，研究其制備工藝和抗氧化肽的抗氧化性能。結果表明：鯉魚抗氧化肽的制備工藝篩選條件為：堿性蛋白酶酶用量100U/mL、酶解時間5h、酶解溫度50℃、pH8.5，此條件下鯉魚肉蛋白肽的最高水解度為15.22%。采用Sephadex G-50對鯉魚水解產物進行分離，水解產物分成分子質量小于5000D和分子質量大于5000D兩個部分，采用亞油酸-硫氰酸鉀法、DPPH自由基法和鄰苯三酚法分別測定鯉魚水解產物的抗亞油酸過氧化能力、DPPH自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力，發現分子質量小于5000D的鯉魚蛋白多肽是水解物中主要的抗氧化成分。

鯉魚肉；酶解；小分子肽；抗氧化

我國淡水魚資源豐富，鯉魚的產量尤為突出，而且其蛋白質含量高達15%以上，氨基酸組成比例平衡，開發潛力巨大[1]。鯉魚經堿性蛋白酶水解，可以得到小肽，由于小肽具有吸收快、營養平衡、易于利用的特點[2]，可廣泛應用于老年人保健食品、運動員營養食品等諸多方面[3]。本實驗以鯉魚肉蛋白為原料，進行鯉魚肉酶解工藝參數的優化研究，在此基礎上，研究鯉魚抗氧化肽的分子質量分布變化和鯉魚蛋白肽的抗氧化特性，探索鯉魚深加工途徑，為鯉魚抗氧化肽的應用提供理論參考。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

鯉魚購于農貿市場。

堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、復合蛋白酶 美國Sigma公司；硫氰酸鉀、冰醋酸 汕頭市西隴化工廠；亞油酸 上海化學試劑公司；EDTA 汕頭市光華化學廠；SDS-PAGE低分子質量標準蛋白、鄰苯三酚、Folin-酚 北京鼎國生物技術有限責任公司；異丙醇、福林試劑、碳酸鈉溶液、三氯乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、酪素、硫酸銅均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JA31001電子天平 上海精天電子儀器有限公司；DHG-9141A電熱恒溫干燥箱 上海精宏試驗設備有限公司；1700紫外-可見分光光度計 日本島津公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠；AUY220分析天平 德國Philippines公司；HZQ-C空氣恒溫振蕩器 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鯉魚肉蛋白的預處理

首先，新鮮的鯉魚去頭、尾、骨、內臟等雜質。取鯉魚精肉，進行切塊。切塊之前微凍，再切成小塊，然后進行脫脂處理[4]。具體過程：將樣品與異丙醇1:1(V/V)混合，45℃條件下，恒溫攪拌100min，然后進行抽濾。抽濾后將樣品置于通風處揮發掉殘余的異丙醇。去除異丙醇后，保存于冰箱中，作為基礎原料備用。

1.3.2 鯉魚蛋白肽的酶解工藝流程

操作要點：在組織搗碎機中勻漿10min；酶解，按不同的酶用量加入蛋白酶，在最適條件攪拌水解一定時間；將酶解液置于沸水浴中加熱10min滅酶。

1.3.3 鯉魚蛋白酶解方法以及單因素試驗

稱取已經脫脂處理的適量鯉魚肉蛋白于盛有100mL蒸餾水的燒杯中混勻，經過預處理，調節到適宜溫度和pH值，按照所需量加入蛋白酶進行水解，為了保持pH值不變，加入氫氧化鈉溶液，并記錄堿液消耗量，換算成水解度(DH)[5]。

1.3.3.1 pH值對水解反應的影響

稱取已經脫脂處理的40g魚肉(已去除水分)分別溶于pH值為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0(酸性蛋白酶、胃蛋白酶)、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶)的100mL水溶液中；然后按酶用量為100U/mL(均以底物計)加入酶，在50℃的水浴鍋中水解4h，研究pH值對水解度的影響[6]。

1.3.3.2 酶解溫度對水解反應的影響

稱取已經脫脂處理的40g魚肉分別溶于100mL水溶液中，其中酸性蛋白酶和胃蛋白酶用4mol/L的HCl調pH值為2.0；堿性蛋白酶用4mol/L的NaOH調pH值為8.0；復合蛋白酶的pH值為7.0。然后按酶用量為100U/mL加入酶，并分別在45、50、55、60、65、72℃的水浴鍋中水解4h，研究溫度對水解度的影響[7]。

1.3.3.3 酶解時間對水解反應的影響

稱取已經脫脂處理的40g鯉魚肉分別溶于100mL水溶液中，其他水解條件同1.3.3節，酶解時間為2、3、4、5、6、7h，研究酶解時間對水解度的影響[8]。

1.3.3.4 酶用量對水解反應的影響

稱取已經脫脂處理的40g鯉魚肉溶于100mL水溶液中，按酶用量為800、900、1000、1100、1200、1300U/mL加入酶，其他條件同1.3.3節，研究酶用量對水解度的影響[9]。

1.3.3.5 堿性蛋白酶水解鯉魚蛋白的正交試驗

參照單因素試驗結果，為了確定最佳工藝參數，對各個因素進行正交優化設計。

1.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳參考文獻[10]。

1.3.5 抗氧化能力的測定方法

1.3.5.1 亞油酸過氧化反應

在5mL具塞玻璃試管加入1.5mL 0.15mol/L(pH7)的磷酸鹽緩沖液，加入質量濃度20g/100mL待測鯉魚蛋白水解物樣品100μL，加入100μL 50mmol/L亞油酸的乙醇溶液和25μL 50mmol/L的FeCl2-EDTA溶液，采用漩渦分散器振蕩后，蓋上玻蓋，于50℃暗處水浴保溫，記錄保溫時間[11-12]。

1.3.5.2 鄰苯三酚方法測定清除自由基能力

在一系列試管中加3mL 0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.2)，分別加入質量濃度20g/100mL待測鯉魚肽樣品溶液100μL，空白組加入同體積蒸餾水，再加入100μL的0.45mol/L鄰苯三酚溶液，振蕩并計時，待計時至3min時立即加入100μL 3%抗壞血酸溶液，振蕩，終止反應，再325nm波長處測吸光度。以抗氧化劑空白的吸光度為A0，加抗氧化劑時吸光度為AS，清除自由基能力SA(scavenging activity)可用公式(1)表示。

1.3.5.3 對DPPH自由基清除能力的測定

準確稱取DPPH標準樣品0.00395g，用溶劑溶解并定容至100mL，得濃度為0.1mmol/mL的母液備用。再用去離子水配制質量濃度為5.0mg/mL的鯉魚酶解物。DPPH自由基是一種非常穩定的自由基，在有機溶劑中呈紫色，在517nm波長處有很大的吸收，當加入抗氧化劑后一部分自由基被清除，使在該波長處吸收減弱，所以借此來評價某種物質的抗氧化性。將上述所得母液稀釋到各種質量濃度，取2mL各質量濃度的樣品加入到2mL DPPH自由基混合搖勻，于25℃水浴加熱20min左右，在517nm波長處測得樣品吸光度(Ai)，做2個樣品(取平均值)，同時以2mL樣品溶液中加入2mL蒸餾水測得吸光度(Aj)，除此之外，在取2mL蒸餾水代替樣品加入2mL DPPH自由基溶液測得空白吸光度(A0)。同時以VC做陽性對照，按公式(2)計算DPPH自由基清除率[13-14]。

1.3.6 已知分子質量多肽標準品的凝膠層析

將已知分子質量標準品桿菌肽、血管緊縮素、亮氨酸腦啡肽和牛血清白蛋白分別配成1%的溶液，經微孔膜過濾后分別進樣1mL[15-16]，因為G-50凝膠的分離范圍是1000～30000D，大于5000D的物質先直接從凝膠間隙出來，牛血清白蛋白的分子質量是67000D，因此其保留時間約等于分子質量為5000D物質的保留時間，其保留時間對應的分子質量為5000D左右。

表 1 標準物質的分子質量與保留時間Table 1 Molecular weights and retention times of protein markers

采用最小二乘法求出直線相應的回歸方程式為：

式中：Y為分子質量對數；X為保留時間。因此，采用該回歸方程可以根據某物質在凝膠柱的保留時間估算出該物質的分子質量大小。

2 結果與分析

2.1 5種蛋白酶水解鯉魚蛋白單因素試驗

2.1.1 pH值對水解反應的影響

圖 1 pH值對鯉魚蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of pH on degree of hydrolysis

由圖1可知，堿性蛋白酶的水解效果最佳。在pH值小于8.0時，隨pH值增大鯉魚蛋白水解度升高；當pH8.0水解度達到最大值為12.99%，pH值繼續升高水解度則降低。這是因為酶分子是一種特殊的蛋白質分子，具有若干個活性部位[2]，酶的活性部位由結合位點和催化位點組成。結合部位和催化部位對反應體系的pH值變化比較敏感，其解離狀態隨pH值的變化而變化，這些變化影響了酶分子的特殊構象。因此pH值的變化直接影響了酶與底物的結合和催化，是酶催化反應的主要因素之一。中性蛋白酶次之，在pH7.0時水解效果最佳。酸性蛋白酶和胃蛋白酶的最適pH值為2～3，但隨著pH值不斷增大，水解度逐漸減小。復合蛋白酶的最適pH值為中性。

2.1.2 酶解溫度對水解反應的影響

由圖2可知，當溫度小于60℃時，鯉魚蛋白水解度隨溫度的增加而升高，當溫度為60℃時，5種酶都達到了最佳的水解條件，其中堿性蛋白酶對蛋白質的水解效果最佳，水解度達到最大為13.22%，當溫度繼續增加時，酶對蛋白質的水解度下降，為此在本實驗條件下堿性蛋白酶水解鯉魚的最適溫度為60℃。水解溫度對蛋白酶的影響表明，溫度較低時，溫度升高加速水解反應處于主導地位；當溫度較高時，酶失活處于主導地位，使水解速率加快的同時酶失活速率更快。

圖 2 酶解溫度對鯉魚蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of temperature on degree of hydrolysis

2.1.3 酶解時間對水解反應的影響

圖 3 酶解時間對鯉魚蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

由圖3可知，分別在5種酶最佳水解溫度、pH值的條件下進行水解，堿性蛋白酶的效果最佳。即溫度50℃、酶用量100U/mL、pH8時水解效果最佳。當酶解時間小于5h，隨酶解時間的增加，水解度逐漸升高，而當酶解時間大于5h時，水解度增加不是很明顯，為了節約時間，所以在本實驗條件下堿性蛋白酶水解鯉魚蛋白的最適酶解時間為5h，此時水解度為14.02%。另外，如果水解時間過長，就會使小分子肽水解成氨基酸，不利于能收集到更多具有較強抗氧化活性的多肽。中性蛋白酶的最適水解時間大約為5.5h；酸性蛋白酶的最佳水解時間大約為6h；胃蛋白酶的最適佳水解時間大約為5h；復合蛋白酶隨著水解時間的增加，水解度不斷增大，但是在7h后的變化也趨于平緩，它的最適水解時間大約為7h。

2.1.4 酶用量對水解反應的影響

圖 4 酶用量對鯉魚蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis

由圖4可知，分別在5種酶各自最適的溫度、pH值、酶解時間的條件下進行水解，堿性蛋白酶的效果最佳，即溫度50℃、酶解時間5h、pH8時水解效果最佳。當酶用量小于1100U/mL時，隨酶用量的增加，水解度逐漸升高，而當酶用量大于1100U/mL時，水解度的變化幅度較小，由于酶的價格比較高，因此在本實驗條件下堿性蛋白酶水解鯉魚蛋白的最佳酶用量為1100U/mL，此時水解度為14.2%。

當水解反應溫度、pH值、底物用量不變且足夠大時，實驗測得酶的數量越多則生成的多肽越多，水解度越大。相反，如果底物不足，酶分子過量，很多酶分子根本不能發揮作用，水解度相對降低，會造成不必要的浪費。

2.2 堿性蛋白酶水解鯉魚蛋白正交試驗

分別用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復合蛋白酶酶解鯉魚肉，通過單因素試驗測定水解度，通過對5種實驗用酶分別在不同實驗條件下水解魚肉蛋白進行對比分析。結果表明堿性蛋白酶的水解效果最好，中性蛋白酶次之。所以選用堿性蛋白酶作為實驗用酶。正交試驗的設計方案及結果見表2。由表2可知，利用極差分析法可得出各個因素對堿性蛋白酶對鯉魚蛋白的水解效果的影響順序為：B＞A＞D＞C，即pH值＞酶解溫度＞酶用量＞酶解時間。酶解條件最佳反應組合為A3B3C2D1，即堿性蛋白酶最佳酶解工藝條件為酶解溫度55℃、pH8.5、酶解時間4h、酶用量900U/mL，此時水解度為15.22%。

表 2 各個因素對水解度正交試驗結果分析Table 2Factors and levels for orthogonal array design

2.3 Sephadex G-50測定鯉魚蛋白肽混合物分子質量分布圖5是鯉魚蛋白經酶水解后，水解產物經過Sephadex G-50型凝膠柱層析所得到的洗脫圖，從圖中可看到多肽分子從大到小是連續分布的，即水解物存在著各種大小不等的肽分子。水解物中多肽主要分布在14～26管(鯉魚蛋白肽A)、50～65管(鯉魚蛋白肽B)，這兩處波峰處總面積占2/5左右。根據樣品在凝膠柱的保留時間帶代入回歸方程，得出鯉魚蛋白肽A的分子質量大約為10000D，鯉魚蛋白肽B的分子質量大約為5000D。從總體上看該酶水解的產物比較分散，集中性差，鯉魚蛋白的水解非常不均勻，水解物各成分分子質量相差很大。

圖 5 鯉魚蛋白水解物的Sephadex G-50柱洗脫圖譜Fig.5 Elution prof i le on Sephadex G-50 column of carp protein peptides

圖 6 鯉魚蛋白及其水解產物的SDS-PAGE圖譜以及分子質量Fig.6 SDS-PAGE analysis of carp protein and hydrolysis products

圖6顯示的是鯉魚蛋白采用堿性蛋白酶的水解物，對比圖中標準物質的電泳帶可以看出，鯉魚蛋白肽A的分子質量分布在6500～15000D，鯉魚蛋白肽B的分子質量分布在1000～5000D。

2.4 鯉魚蛋白肽的抗氧化能力

2.4.1 抗亞油酸過氧化能力

表 3 水解物各組分的抗氧化能力Table 3 Antioxidative activity of different fractions of hydrolysate determined by linoleic acid-potassium thiocyanate method

由表3可知，在濃度相同時，鯉魚蛋白、鯉魚蛋白水解產物及其分離組分鯉魚蛋白肽A、鯉魚蛋白肽B均具有明顯的防止亞油酸過氧化能力。抗亞油酸過氧化能力從低到高的順序依次是鯉魚蛋白、鯉魚蛋白肽A、水解物、鯉魚蛋白肽B，說明分子質量1000～5000D的鯉魚蛋白肽是水解物中起主要抗氧化作用的成分。通過和丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、沒食子酸丙酯陽性對照組比較[17]，可以發現20g/100mL的鯉魚蛋白肽B的防止亞油酸過氧化能力甚至強于0.02%丁基羥基茴香醚、0.02%二丁基羥基甲苯，而略弱于沒食子酸丙酯。

2.4.2 清除自由基能力

表 4 鯉魚蛋白肽清除自由基能力Table 4 Free radical scavenging capacity of different fractions of hydrolysate

由表4可知，清除自由基能力從低到高的順序依次是鯉魚蛋白、鯉魚蛋白肽A、水解物、鯉魚蛋白肽B、VC、VE陽性對照組。從這個順序可以看出，水解物及其兩個凝膠分離組分的清除自由基能力的順序和抗亞油酸過氧化能力結果基本保持一致，更加表明小分子鯉魚蛋白肽在水解物中起主要抗氧化作用[18-20]，盡管和VE、VC相比鯉魚蛋白肽B的清除自由基能力稍弱，但考慮到VE、VC是一種高效的抗氧化劑，為準確測定吸光度，在本實驗中VC甚至是作為鄰苯三酚自氧化反應的阻止劑來使用，鯉魚蛋白肽B的清除自由基能力還是比較令人滿意的。說明分子質量1000～5000D的鯉魚肽是水解物中起主要抗氧化作用的成分。

2.4.3 DPPH自由基清除能力

表 5 鯉魚蛋白肽清除DPPH自由基能力Table 5 DPPH scavenging capacity of different fractions of hydrolysate

由表5可知，鯉魚蛋白多肽對DPPH自由基的清除率明顯高于鯉魚蛋白，鯉魚蛋白肽B清除率可達到43.6%。

3 結 論

本實驗采用正交試驗方法研究并確定堿性蛋白酶最佳水解工藝條件。鯉魚肽經Sephadex G-50凝膠層析分離經酶水解的鯉魚蛋白，水解產物分成分子質量小于5000D和分子質量大于5000D兩個部分，分別測定鯉魚水解產物的抗亞油酸過氧化能力和清除自由基能力，確定分子質量小于5000D的鯉魚蛋白肽是水解物中主要的抗氧化成分。本實驗中獲得的鯉魚蛋白肽研究結果為其應用研究提供一定的科學理論依據。例如根據鯉魚肽的抗氧化性，可以將其作為天然的防止食品腐敗變質的添加劑應用到食品中，以取代化學合成的防腐劑；也可將其作為抗衰老成分添加到化妝品中發揮養顏和延緩衰老的作用。

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Enzymatic Preparation of Bioactive Peptides from Carp Meat and Their Antioxidant Activity

MA Jing-xi1，SUN Yong-jie1，FENG Yin1，MIN Wei-hong2,*
(1. Biology-food School, Development College, Jilin Agricultural University, Changchun 130600, China；2. College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

In this study, bioactive peptides were enzymatically prepared from carp meat using alkaline protease. The optimum conditions for preparing bioactive peptides were found to be hydrolysis at 50 ℃ and pH 8.5 for 5 h with an enzyme dosage of 100 U/mL. Under these conditions, the maximum degree of hydrolysis was 15.22%. The resulting hydrolysate was separated by Sephadex G-50 column chromatography into two fractions: greater than 5000 D and smaller than 5000 D. Peptides with molecular weight smaller than 5000 D were mainly responsible for the anti-linolie acid peroxidation activity and radical scavenging activities against DPPH and superoxide anion radicals of the hydrolysate.

carp meat；enzyme；small molecular peptide；antioxidation

TS218

A

1002-6630(2013)01-0225-05

2011-10-06

吉林省教育廳科研項目

馬井喜(1981ü)，男，講師，碩士，研究方向為功能性食品。E-mail：majingxi0821@163.com *通信作者：閔偉紅(1971ü)，女，教授，博士，研究方向為發酵工程。E-mail：minwh2000@163.com