巴西松子中蛋白酶的分離純化及酶學性質

肖 麗，應鐵進*，蔡路昀，韓曉旭

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310029)

巴西松子中蛋白酶的分離純化及酶學性質

肖 麗，應鐵進*，蔡路昀，韓曉旭

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310029)

在單因素試驗基礎上，通過正交試驗研究pH值、提取時間和料液比3個因素對巴西松子中蛋白酶活力的影響，得出巴西松子中蛋白酶的最佳提取緩沖液為pH9.0的硼酸-硼砂緩沖液、提取時間為60min、料液比為1:8(m/V)；采用(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析分離純化巴西松子中的一種蛋白酶，結果表明：純化后蛋白酶比活力提高到了8.61倍，回收率為21.65%。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析表明：該蛋白酶分子質量為33kD。酶學性質結果表明：該蛋白酶最適pH值為9.0，屬堿性蛋白酶；反應的最適溫度為50℃；金屬離子Mn2+對該蛋白酶活性有強烈的激活作用，而Ca2+、Mg2+和Cu2+對酶活性有抑制作用。

巴西松子；蛋白酶；分離純化；酶學性質

巴西松子(Araucaria angustifolia (Bert) O. Ktze)，是一種重要的國際性貿易商品，主要分布在喜馬拉雅山區(qū)[1]，如阿富汗東部、巴基斯坦北部、印度查謨克什米爾地區(qū)以及我國的西藏。松子含有人體必需的多種營養(yǎng)，如VA、VE、磷脂、多糖、黃酮等，并且富含不飽和脂肪酸[2-3]，在全世界范圍內廣泛應用于甜食、糕點或者色拉的配料中，備受歷代醫(yī)家和營養(yǎng)學家的推崇。

巴西松子一季采收，周年供應，因此，需要進行商業(yè)性的長期貯藏。貯藏過程中的品質劣變是制約貯藏壽命的重要因素。除了油脂氧化，產生蛤喇味外，由寡肽、氨基酸含量變化導致的鮮度下降也是品質劣變的一個重要方面。蛋白酶參與松子貯藏過程中蛋白質的代謝過程，因而直接影響到松子的營養(yǎng)與品質變化。國內外對松子油[3-6]、松仁過敏性[7-9]和松仁蛋白[10-11]已經有所研究，但未見對松子中蛋白酶的研究報道。因此，本實驗研究松子中蛋白酶的分離純化，對于了解松子的品質劣變機制、改進松子貯藏條件具有重要的意義，并可為該酶進一步應用于食品、醫(yī)藥等方面提供有價值的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴西松子產自巴基斯坦，保存于―3℃；DEAESepharose FF 北京鼎國生物技術有限責任公司；福林酚(分析純) 上海源聚生物科技有限公司；低、高分子質量SDS-PAGE蛋白標準品 美國Bio-Rad公司；牛血清白蛋白(BSA，生化純) 北京普博斯生物科技有限公司。

722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；AKTAprime plus低壓層析系統(tǒng) 通用電氣(中國)醫(yī)療集團；CHRIST冷凍干燥機 上海匯分電子科技有限公司；EPS-300垂直電泳儀 上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 巴西松子蛋白酶提取

取5g經過石油醚萃取完全脫脂的巴西松子果仁粉，加入40mL緩沖液，在4℃條件下研磨充分后，靜置60min，離心(4℃、8000r/min、30min)，取上清液，緩慢加入(NH4)2SO4至80%飽和度，于4℃冰箱中靜置2h后，再次離心取沉淀，溶解于原緩沖液，得到粗酶液。采用對比實驗對緩沖液pH值、提取時間和料液比進行初步篩選，將提取時間分別設置為20、40、60、80、100min，料液比(m/V)為1:4、1:6、1:8、1:10、1:12，pH值分別調整為8.0、9.0、10.0、11.0，采用正交試驗獲得最佳提取工藝條件。

1.2.2 蛋白酶純化

采用(NH4)2SO4沉淀法粗步純化蛋白酶，將鹽析后得到的粗酶液經過DEAE-Sepharose FF層析柱[12-13](1.6cmh40cm)進一步分離純化，用含0～1mol/L NaCl的硼酸-硼砂緩沖液(pH9.0)線性梯度洗脫[14]，流速2mL/min，5mL/管分別收集，280nm波長處檢測，計算在活性峰范圍內每管蛋白酶活性、總蛋白含量。挑選出純化倍數高的樣品，真空凍干得到樣品粉末，在―70℃保存，用于電泳分析及蛋白酶性質研究。

1.2.3 SDS-PAGE電泳

純化后的蛋白酶按文獻[15]的方法進行SDS-PAGE電泳。其中分離膠和濃縮膠的體積分數分別采用10%和5%[16]。電泳完畢后，小心取出膠片，置于固定液中固定30min，再用考馬斯亮藍R250染色至少2h，最后用脫色液脫色至凝膠背景透明后保存在保存液中，測定其純度及分子質量[17]。

1.2.4 蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白酶的蛋白質含量，以BSA作為標準蛋白。用紫外-可見分光光度計依次測定每管收集液在280nm波長處[18]的吸光度，得到蛋白質含量。

1.2.5 蛋白酶活力的測定

以2%酪蛋白為底物，按照福林酚測定法[14,19]并加以改進。取3支試管編號，分別加入1.0mL酶液，于40℃水浴鍋中預熱2～3min，加入1.0mL 40℃預熱的2%酪蛋白，于40℃反應10min，再加入2.0mL 0.4mol/L三氯醋酸反應15min過濾，取濾液1.0mL放入盛有5mL Na2CO3溶液的試管中，加入1.0mL 福林-酚試劑于40℃水浴發(fā)色20min。同時做空白對照，即加入酶液后直接用2.0mL 0.4mol/L三氯醋酸沉淀酶并使酶失活，然后再加入2%的酪蛋白。酶活力單位定義為1mL酶液在40℃和pH9.0的條件下，1min水解酪蛋白產生1μg酪氨酸為1個酶活力單位，以U表示。

1.2.6 蛋白酶的酶學特性

1.2.6.1 酶的熱穩(wěn)定性

將1mL酶液分別置于20～90℃水浴鍋中分別保溫20、30、40、50、60min，再測定酶活性。

1.2.6.2 最適反應溫度

將反應溫度分別設為20～90℃，根據1.2.6.1節(jié)的結果，測定酶活性。

1.2.6.3 最適pH值

將酶反應液的pH值分別調整為3.0～11.0(pH3.0～5.0用0.05mol/L乳酸鹽緩沖液，pH7.0～8.0用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH9.0～11.0用0.05mol/L硼酸鹽緩沖液)，根據1.2.6.2節(jié)的結果，在最適反應溫度條件下測定酶活性。

1.2.6.4 金屬離子對酶活性的影響

在硼酸-硼砂緩沖液中分別加入濃度為10mmol/L的Na+、Mg2+、K+、Ca2+、Mn2+和Cu2+，根據1.2.6.2節(jié)的結果，在最適反應溫度條件下測定酶活性。

2 結果與分析

2.1 巴西松子果仁中蛋白酶的分離提取

2.1.1 不同pH值緩沖液對蛋白酶活力的影響

重蒸水、乳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液和Tris-HCl緩沖液，這5種浸提溶劑常用于提取蛋白酶[20-22]，為探討不同的提取方法對酶活力的影響程度，實驗取5g脫脂松子果仁粉分別加入30mL的上述5種浸提溶劑，混合勻漿，粗濾后于4℃、8000r/min離心30min，取上清液得粗蛋白酶液，測定蛋白酶活力。

表 1 不同提取溶劑提取液的酶活力Table 1 Effect of different solvents on the extraction eff i ciency of protease activity

圖 1 pH值對巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of solvent pH on the extraction eff i ciency of protease activity

由表1可知，對巴西松子來源的蛋白酶提取效果為硼酸-硼砂緩沖液＞Tris-HCl緩沖液＞磷酸鹽緩沖液＞蒸餾水＞乳酸鹽緩沖液，因此選用硼酸鹽緩沖液效果最好。為了進一步研究硼酸鹽緩沖液pH值對酶活力的影響，用NaOH溶液將硼酸-硼砂緩沖液的pH值分別調整為8.0、9.0、10.0、11.0，在料液比為1:6、提取時間為30min條件下，測定蛋白酶活力。

由圖1可知，隨著pH 值升高，巴西松子蛋白酶活力先增大后減小。在pH8.0～9.0范圍內，蛋白酶活力急速升高，在pH9.0時達到最大值，之后開始下降。故選取pH9.0的硼酸-硼砂緩沖液提取蛋白酶比較適宜，這與蔣麗萍等[10]研究表明堿提松子蛋白質的最佳pH值為10.0相接近。

2.1.2 提取時間對蛋白酶活力的影響

圖 2 提取時間對巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction eff i ciency of protease activity

從植物中提取蛋白酶，提取效果與提取溶劑和提取時間有關。時間太短導致酶不能充分溶解到提取溶劑中，時間太長會降低酶活力測定效率。在料液比為1:6、pH9.0條件下，測定不同提取時間的蛋白酶活力。由圖2可知，在20～60min，隨著提取時間延長，蛋白酶活力也隨之增加，當60min時達到最大值，此后隨著時間延長酶活力略微上升，提取時間為80min和100min差別不大，說明60min時，蛋白酶已經基本提取飽和。因此選取提取時間為60min。

2.1.3 料液比對蛋白酶活力的影響

圖 3 料液比對巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction eff i ciency of protease activity

料液比如果太低，酶不能充分溶解，會影響蛋白酶提取效果，進而導致酶活力下降；料液比如果太高，又會增加后處理負擔。為了尋找較佳提取松子蛋白酶的料液比，分別選取料液比1:4、1:6、1:8、1:10、1:12，緩沖液pH9.0，在4℃提取60min條件下，測定蛋白酶活力。由圖3可知，當料液比從1:4降低到1:6時蛋白酶活力不斷升高，此后隨著料液比進一步降低，酶活力略微波動，總體趨于穩(wěn)定，因此選取料液比1:6進行提取比較適宜。

2.2 正交試驗優(yōu)化巴西松子蛋白酶提取工藝結果

在單因素試驗基礎上，進行正交試驗可以進一步確定最佳工藝參數[10]，以提取時間、緩沖液pH值和料液比為試驗因素，進行三因素三水平正交試驗，優(yōu)化提取巴西松子蛋白酶的最佳工藝參數，試驗因素與水平設計見表2，并應用SAS軟件進行方差分析，見表3。

表 2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal array design and results

表 3 正交試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表2極差分析可知，影響巴西松子蛋白酶活力的因素順序為A＞C＞B，因素A(提取時間)為顯著影響因素，綜合考慮提取效率與成本，提取的最優(yōu)水平組合為A2B2C3。即巴西松子蛋白酶在pH9.0的硼酸-硼砂緩沖液中以料液比為1:8、提取60min為最佳提取條件。在此條件下，蛋白酶活力為387.48U。提取時間對酶活力影響最顯著，與表3方差分析結果吻合。

2.3 巴西松子蛋白酶的純化

2.3.1 (NH4)2SO4沉淀

硫酸銨沉淀法可從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質，因其溶解度大、溫度系數小和不易使蛋白質變性而廣泛應用于酶的分離提純中[14,22-23]。當溶液鹽濃度增加時上清液中蛋白酶的溶解度減少，鹽濃度太高時，會發(fā)生鹽析現象，因此合適的鹽濃度對純化蛋白酶十分必要。采用飽和度分別為20%～90%的硫酸銨分別將蛋白酶提取液鹽析，4℃靜置過夜后，8000r/min離心30min，收集上清液，再用福林酚法分別檢測上清液的蛋白酶活力，并與鹽析前提取液蛋白酶活力進行比較，見圖4。

圖 4 不同硫酸銨飽和度對上清液蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of saturation degree of ammonium sulfate on the recovery of protease activity

鹽析分級沉淀結果表明，當硫酸銨飽和度＜20%時，上清液中酶活力跟原液相差不大。當硫酸銨飽和度為80%時，上清液中幾乎檢測不到酶活力，即80% (NH4)2SO4飽和度可有效沉淀目標蛋白酶。因此，實驗采用80%飽和度硫酸銨沉淀目標蛋白酶。這與黃光榮等[14]采用80%的(NH4)2SO4鹽析提取嗜熱芽孢桿菌HS08結果相似，而曾小波等[23]研究的醬油曲蛋白酶最佳飽和度是85%。這說明了同一種鹽濃度對不同蛋白酶表面水化膜的破壞程度不一樣，蛋白質的溶解度也不一樣。

2.3.2 DEAE-Sepharose FF層析

圖 5 DEAE-Sepharose FF層析的洗脫曲線Fig.5 Elution prof i le of protease on DEAE-Sepharose FF column

將(NH4)2SO4沉淀后得到的粗酶液，于0.05mol/L 硼酸-硼砂緩沖液中4℃透析脫鹽12h(透析袋截留相對分子質量為7000)[24]，除去過量鹽離子對下一步層析的影響。透析完成后，體積會擴大50%，因此需要采用真空冷凍干燥成粉末濃縮樣品，再將粉末溶解于10mL緩沖液，經DEAE-Sepharose FF柱層析洗脫得到2個峰，但只有1個峰有蛋白酶活性，檢測每管收集液的酶活力從而得到洗脫曲線(圖5)，將活性洗脫峰收集濃縮后，采用SDS-PAGE的方法檢測其純度。結果表明，該活性峰的純度較高，蛋白質分子質量為33kD左右(圖6)。

圖 6 DEAE-Sepharose FF純化后巴西松子蛋白酶的SDS-PAGE圖譜Fig.6 SDS-PAGE of crude and purif i ed protease

2.3.3 分離純化效率

表 4 巴西松子蛋白酶的分離純化Table 4 Isolation and purif i cation of Brazilian pine nut protease

在粗提蛋白酶的分離純化過程中，各步驟的分離純化效率見表4。結果表明，該蛋白酶經分離后純化倍數達到8.61倍，回收率為21.65%。

2.4 巴西松子蛋白酶的酶學性質

2.4.1 酶的熱穩(wěn)定性

圖 7 溫度對巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.7 Heat stability of protease from Brazilian pine nut

圖7表明，蛋白酶在20～50℃保溫20～60min后酶活力損失較小，在40℃時保溫50min，酶活力最高。但溫度高于50℃時，酶活力迅速降低，當溫度超過80℃時，酶迅速變性，活力喪失80%以上。因此該酶屬于不耐熱范圍。

2.4.2 酶反應的最適溫度

圖8表明，隨著溫度升高，巴西松子蛋白酶的活力逐漸升高，在50℃時達到最大值。之后隨著溫度升高，酶活力逐漸下降，70～80℃變化不明顯，當溫度在90℃時，酶活力下降最顯著，因為酶的化學本質是蛋白質，適當的溫度有利于酶促反應，但溫度過高會導致酶變性。

圖 8 溫度對巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.8 Optimum reaction temperature for protease from Brazilian pine nut

2.4.3 酶反應的最適pH值

適宜的pH值是維持酶活力的重要因素。蔣麗萍[10]、吳曉紅[25]等研究松子的等電點分別為4.6和4.2，推測pH值在4.0左右，酶活力偏低是因為緩沖液的pH值與目標蛋白的等電點一致，導致蛋白的溶解度減少而引起聚集。由圖9可知，巴西松子蛋白酶最適pH值為9.0，該酶在pH＜4.0的酸性條件時，酶活力偏低。pH＞10.0的堿性條件時，酶活力下降不明顯。因此，該酶屬于堿性蛋白酶。

圖 9 pH值對巴西松子蛋白酶活力的影響Fig.9 Effect of pH on the activity of protease from Brazilian pine nut

2.4.4 金屬離子對酶反應的影響

表 5 金屬離子對巴西松子蛋白酶活力的影響Table 5 Effect of metal ions on the activity of protease from Brazilian pine nut

表5表明，Na+和K+對該蛋白酶活性有輕微激活作用，Mn2+的促進作用最強，高達167.68%，而Ca2+和Mg2+對酶活性有較弱的抑制作用，幾乎可以忽略不計，Cu2+的抑制效果最強為25.19%。因此，該酶是Mn2+激活蛋白酶。

3 結 論

通過正交試驗研究pH值、提取時間和料液比3個因素對巴西松子中蛋白酶提取效果的影響，得出巴西松子中蛋白酶的最佳提取緩沖液為pH9.0的硼酸-硼砂緩沖液、提取時間為60min、料液比為1:8；通過硫酸銨沉淀和離子交換層析等方法可將該蛋白酶純化到單峰，純化后蛋白酶的比活力為5.77U/mg，純化倍數為8.61倍，回收率為21.65%。SDS-PAGE電泳進一步確定其分子質量為33kD，推測該酶由均一的亞基組成。該蛋白酶的最適溫度為50℃，最適pH值為9.0，因此，該酶屬于不耐熱的堿性蛋白酶。10mmol/L Mn2+對該蛋白酶有強烈的激活作用，達到2.68倍，而Ca2+、Mg2+和Cu2+對蛋白酶活性有微弱抑制作用，因此推測該蛋白酶為一種Mn2+激活蛋白酶。

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Purif i cation and Properties of Protease from Brazilian Pine (Araucaria angustifolia (Bert) O. Ktze) Nuts

XIAO Li，YING Tie-jin*，CAI Lu-yun，HAN Xiao-xu
(College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

An orthogonal array design was used to optimize conditions for the extraction of protease from Brazilian pine nuts. Boric acid-borate buffer was found to be the best solvent for the extraction of protease, and its optimum pH was 9.0. The optimum extraction time and solid-to-solvent ratio were 60 min and 1:8 (m/V), respectively. Pure protease was obtained from crude extract using salting out with ammonium sulfate followed by DEAE-Sepharose FF column chromatography. After purif i cation, the specif i c activity of protease increased 8.61-fold and the activity recovery was 21.65%. As shown by SDS-PAGE, the molecular mass of the enzyme was 33 kD. Enzymatic characterization demonstrated that it was an alkaline and its optimum reaction pH and temperature were 9.0 and 50 ℃, respectively. In addition, Mn2+had a strong activating effect on the enzyme, whereas Ca2+, Mg2+and Cu2+could inhibit its activity.

Brazilian pine nut；protease；purif i cation；protease activity

Q814.1

A

1002-6630(2013)01-0239-05

2011-11-03

肖麗(1986ü)，女，碩士，研究方向為農產品加工與保鮮。E-mail：sichuanxiaoli@163.com

*通信作者：應鐵進(1958ü)，男，教授，博士，研究方向為果蔬采后分子生物學、果蔬貯運技術。E-mail：tjying@zju.edu.cn