一株乳酸乳球菌所產細菌素的生物學特性

唐春梅，陳俊亮，任廣躍

(1.河北北方學院動物科技學院，河北 張家口 075000；2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

一株乳酸乳球菌所產細菌素的生物學特性

唐春梅1，陳俊亮2，任廣躍2

(1.河北北方學院動物科技學院，河北 張家口 075000；2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003)

對乳酸乳球菌KLDS4.0326所產類細菌素進行分離純化，并對細菌素的部分生物學特性進行研究。在排除酸性產物和過氧化氫的干擾后，菌株的無細胞發酵上清液對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性細菌以及大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性細菌具有顯著的抑制作用；經胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K處理后，抑菌活性降低，表明抑菌成分為蛋白類物質；該細菌素具有良好的熱穩定性，在酸性條件下抑菌活性穩定，并且具有較廣的抑菌譜，能夠抑制多種革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌。

乳酸乳球菌；細菌素；生物學特性

乳酸菌能夠產生多種抗菌物質，如有機酸、雙乙酰、丁酮、過氧化氫、抗真菌肽以及細菌素[1]。細菌素是某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有生物活性的蛋白質、多肽，這些蛋白復合物能夠殺死或抑制與其有相同或相似生活環境的其他微生物[2]。雖然許多革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌也能夠產生細菌素，但是由于乳酸菌細菌素可作為天然防腐劑，能抑制食品中腐敗微生物和致病微生物的生長，所以其在食品產業具有的潛在應用價值備受關注。研究[3-4]表明，某些乳酸菌能有效抑制食源性致病菌中的革蘭氏陽性細菌，如芽孢桿菌屬、李斯特菌屬、葡萄球菌屬以及肉毒梭狀芽胞桿菌屬。此外，一些細菌素也能夠有效抑制某些革蘭氏陰性細菌[5-6]。由于乳酸菌細菌素能夠有效抑制食源性致病菌，以及消費者對更多天然防腐劑的需求，其在食品領域將具有更廣泛的應用前景[7-8]。

本實驗首先對乳酸乳球菌KLDS4.0326產生的細菌素進行分離純化，然后對細菌素的生物學特性如細菌素的抑菌譜，對表面活性劑、蛋白酶、pH值和溫度的敏感性等進行研究，對于尋找新型乳酸菌細菌素具有一定的意義，并為將來開發新的細菌素天然防腐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基與試劑

1.1.1 細菌素產生菌株

乳酸乳球菌KLDS4.0326來源于內蒙古傳統乳制品酸馬奶，分離鑒定后，凍存于乳品科學教育部重點實驗室工業微生物菌種保藏中心(KLDS-DICC)。

1.1.2 指示菌菌株

金黃色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u re u s) ATCC25923、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)NICPBP54002和沙門氏菌(Salmonella)ATCCl4028由中國藥品生物制品檢定所提供；大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922由黑龍江省微生物研究所提供；其他標準菌株由KLDS-DICC提供。

1.1.3 培養基

乳酸乳球菌和腸球菌選擇M17培養基 青島海博生物技術有限公司；乳桿菌選擇改良MRS培養基、單核細胞增生李斯特氏菌選擇TSA-YE培養基、其他指示菌用營養肉湯及營養瓊脂培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.4 試劑

胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、過氧化氫酶美國Sigma公司；蛋白酶K 日本TaKaRa公司；HCl、NaOH、(NH4)2SO4均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

SPX-150B生化培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；瑞士比歐KLF2000 3.7L發酵罐 瑞士比歐生物工程公司；Delta320pH計 瑞士梅特勒-托利多有限公司；ALPHA 1-4型凍干機 德國Marin Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 制備無細胞發酵上清液

將凍干保存的乳酸乳球菌KLDS4.0326，接種于脫脂乳培養基中，置于30℃培養16h，再以1%的接種量接種于改良MRS培養基中，30℃培養至穩定期，在4℃、10000hg離心15min，收集上清液，調pH值至6.5，用0.22μm濾膜過濾上清液，保存于4℃冰箱備用[9-10]。

1.3.2 制備細菌素粗提液

取1L無細胞發酵上清液，用70%飽和度的硫酸銨鹽析，在4℃振蕩過夜，再于4℃、10000hg離心20min，收集沉淀，溶于0.02mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH6.5)，所得溶液即為細菌素粗提液。

1.3.3 排除過氧化氫的干擾

過氧化氫酶溶解在20mol/L的乙酸鹽緩沖液(pH6.5)中配成母液，加入無細胞發酵上清液中使過氧化氫酶的終質量濃度為5mg/mL，30℃水浴2h后，檢測過氧化氫酶處理后無細胞發酵上清液的抑菌活性，用加入等量乙酸鹽緩沖液的無細胞發酵上清液作為對照。

1.3.4 抑菌活性的檢測

采用牛津杯雙層瓊脂法[11]：在無菌平皿中傾倒入10mL 2%瓊脂。制備含0.7%瓊脂指示菌培養基，接種體積分數1%過夜培養的指示菌菌液，將10mL含有指示菌的軟瓊脂培養基傾倒在事先倒好的瓊脂培養基上，將預先滅菌的牛津杯放上，在牛津杯的孔中加入100μL發酵上清液，在超凈工作臺上靜置3h，30℃培養48h，若在牛津杯周圍出現抑菌圈，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，每種指示菌株做3個平行實驗。

1.3.5 細菌素抑菌譜

選取典型的革蘭氏陽性細菌ü ü乳酸乳球菌、腸球菌、乳桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、芽孢桿菌以及革蘭氏陰性細菌üü大腸桿菌、假單胞菌和沙門氏菌等為指示菌，用細菌素粗提液進行抑菌實驗。

1.3.6 細菌素對pH值敏感性及不同pH值條件下的熱穩定性

取3mL無細胞發酵上清液，用2.0mol/L的NaOH和HCl溶液調整pH值至2～10，分別測其抑菌活性，然后分別在60、80、100、121℃保持20min，冷卻后進行抑菌實驗，用25℃放置20min的處理作為對照。

1.3.7 細菌素對蛋白酶的敏感性

取3mL無細胞發酵上清液，并調節pH值為以下各種酶的最適pH值。按終質量濃度1mg/mL分別加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，在30℃溫育2h，然后將pH值調至6.5，進行抑菌實驗，用不加蛋白酶的無細胞發酵上清液作為對照。

1.3.8 細菌素對表面活性劑的敏感性

取3mL無細胞發酵上清液，分別加入SDS、吐溫-20、吐溫-80、EDTA和Triton X-100，使各物質的終質量濃度達到1mg/mL，30℃溫育2h，進行抑菌實驗，用不加表面活性劑的無細胞發酵上清液作為對照。

1.3.9 統計分析

2 結果與分析

2.1 排除過氧化氫的干擾

無細胞發酵上清液(pH6.5)用過氧化氫酶進行處理，以未經過氧化氫酶處理的發酵上清液作為對照，以金黃色葡萄球菌ATCC25923為指示菌進行抑菌實驗，發現發酵上清液經過氧化氫酶處理后，抑菌圈直徑為(13.29f0.14)mm，與作為對照的發酵上清液的抑菌圈直徑((13.58f0.26)mm)相比略有下降，表明發酵上清液中的過氧化氫不是主要的抑菌物質，還有其他抑菌物質對指示菌起到抑制作用。

2.2 細菌素抑菌譜

選取20株有代表性的革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌為指示菌，用細菌素粗提液進行抑菌實驗，結果見圖1和表1。由圖1可知，發酵上清液中的過氧化氫不是主要的抑菌物質，還有其他抑菌物質對指示菌起到抑制作用，從而達到排除過氧化氫干擾的目的。由表1可知，乳酸乳球菌KLDS4.0326產生的細菌素對20株指示菌中的18株有不同程度的抑制作用，其中不僅對革蘭氏陽性細菌(金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌)具有較好的抑制作用，還可以抑制革蘭氏陰性細菌(熒光假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌等)，表明KLDS4.0326所產細菌素具有較廣的抑菌譜。

圖 1 無細胞發酵上清液對金黃色葡萄球菌(a)和沙門氏菌(b)的抑制效果Fig.1 Antibacterial activity of the cell-free fermentation supernatant of strain KLDS 4.0326 against Staphylococcus aureusand Salmonella

表 1 乳酸乳球菌KLDS4.0326所產細菌素的抑菌譜(x±s，n=3)Table 1 Antibacterial activity of bacteriocin produced by strain KLDS4.0326 (x±s，n=3)

2.3 細菌素對pH值敏感性及不同pH值條件下的熱穩定性

表 2 細菌素pH值敏感性以及不同pH值條件下的熱穩定性Table 2 pH sensitivity and thermal stability of bacteriocin produced by strain KLDS4.0326

將無細胞發酵上清液先調至不同pH值后，測定其對金黃色葡萄球菌的抑制活性，再置于不同溫度下加熱15min后測其抑菌活性，結果見表2?？芍?，乳酸乳球菌KLDS4.0326所產細菌素在pH2～5條件下抑菌活性較強，隨著pH值升高，抑菌活性逐漸下降。細菌素在酸性條件下能保持較高的抑菌活性，但是高pH值條件下抑菌活性減弱，可能是由于pH值變化導致細菌素的蛋白質結構構象發生改變[12-13]。這與許多乳酸菌所產生細菌素的特性相似，在低pH值時抑菌活性較強，在pH值偏中性時，抑菌活性減弱，此類細菌素屬于酸性細菌素[14]。因此，乳酸乳球菌KLDS4.0326所產細菌素適合作為酸性食品防腐劑。無細胞發酵上清液經不同溫度處理后，隨著溫度升高，抑菌活性逐漸下降，這是由于高溫導致蛋白質或多肽失活，使得細菌素抑菌活性降低。在pH2～8范圍內細菌素表現出較強的熱穩定性，在pH4條件下，經121℃處理15min后，其抑菌活性下降7.8%。因此，在巴氏殺菌的條件下細菌素能保持較高的抑菌活性，使其具有在食品工業中應用的潛力。

2.4 細菌素對蛋白酶的敏感性

表 3 不同蛋白酶對細菌素抑菌活力的影響Table 3 Effect of different proteases on the antibacterial activity of bacteriocin produced by strain KLDS4.0326

由表3可知，經過胃蛋白酶、胰蛋白酶處理后抑菌活性略有下降，說明乳酸乳球菌KLDS4.0326細菌素能夠對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌產生抑制作用，此外，還可被蛋白酶K、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶部分失活，使抑菌活性下降，結果表明該細菌素是一種蛋白類物質，由于可被蛋白酶降解而不會在體內殘留，具有較高的安全性。

2.5 細菌素對表面活性劑的敏感性

表 4 表面活性劑對細菌素抑菌活力的影響Table 4 Effect of different surfactants on the antibacterial activity of bacteriocin produced by strain KLDS4.0326

由表4可知，經吐溫-20、吐溫-80、Triton X-100處理后，對枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的抑菌活性無顯著變化(P＞0.05)；但是經SDS處理后細菌素抑菌活性增強。EDTA本身對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有一定的抑菌作用，因此，無細胞發酵上清液與抗菌物質同時使用比單獨使用時抑菌效果好。這是因為抑菌物質對微生物的抑制作用是通過影響細胞亞結構而實現的，這些亞結構包括細胞壁、細胞膜、與代謝有關的酶、蛋白質合成系統及遺傳物質[15]。因此，抑菌物質只要作用于其中的一個亞結構便能達到殺菌或抑菌的目的，當多種抑菌物質協同作用時，可產生更佳的抑菌效果。

3 結 論

乳酸乳球菌KLDS4.0326來源于內蒙古傳統乳制品，其產生的細菌素對多種革蘭氏陽性細菌以及革蘭氏陰性細菌具有較強的抑制作用。在酸性條件下表現出良好的熱穩定性；經多種蛋白酶處理后，抑菌活性降低，表明抑菌成分為蛋白類物質；經SDS和EDTA處理后，其抑菌活性顯著增強。因此，乳酸乳球菌KLDS4.0326所產生的細菌素具有良好的熱、酸穩定性和較廣的抗菌譜，在食品保藏劑方面具有潛在的應用價值。

[1] de VUYST L, LEROY F. Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications[J]. J Mol Microbiol Biotechnol, 2007, 13: 194-199.

[2] DEEGAN L H, COTTER P C, HILL C, et a1. Bacteriocins: biological tools for biopreservation and shelf-life extension[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(9): 1058-1071.

[3] TODOROV S D, DICKS L M T. Screening for bacteriocin-producing lactic acid bacteria from Boza, a traditional cereal beverage from Bulgaria[J]. Process Biochem, 2006, 41: 11-19.

[4] TODOROV S D, BOTES M, DANOVA S T, et al. Probiotic properties of Lactococcus lactis ssp. lactis HV219, isolated from human vaginal secretions[J]. J Appl Microbiol, 2007, 103(3): 629-639.

[5] TODOROV S D, DANOVA S T, van REENEN C A, et al. Characterization of bacteriocin HV219, produced by Lactococcus lactis subsp. lactis HV219 isolated from human vaginal secretions[J]. J Basic Microbiol, 2006, 46: 226-238.

[6] MILLETTE M, DUPONT C, ARCHAMBAULT D, et al. Partial characterization of bacteriocins produced by human Lactococcus lactis and Pediococccus acidilactici isolates[J]. J Appl Microbiol, 2007, 102(1): 274-282.

[7] CLEVELAND J, MONTVILLE T J, NES I F, et al. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation[J]. Int J Food Microbiol, 2001, 71: 1-20.

[8] GáLVEZ A, ABRIOUEL H, LóPEZ R L, et al. Bacteriocin-based strategies for food biopreservation[J]. Int J Food Microbiol, 2007, 120: 51-70.

[9] NIETO-LOZANO J C, REGUERA-USEROS J I, PELDEZMARTFNEZ M C, et a1. Effect of a bactedoein produced by Pediococcus acidilactici against Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens on Spanish raw meat[J]. Meat Science, 2006, 72: 57-61.

[10] CABO M L, MURADO M A, GONZALEZ M P, et a1. A method for bacteriocin quantif i cation[J]. Journal of Applied Microbiology, 1999, 87(6): 907-914.

[11] POATTANACHAIKUNSOPON P, PHUMKHACHONN P. Isolation and preliminary characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum No.14 isolated from Nham, a traditional Thai fermented pork[J]. Journal of Food Protection, 2006, 69: 1937-1943.

[12] NETTLES C G, BAREFOOT S F. Biochemical and genetic characteristics of bacteriocins of food-associated lactic acid bacteria[J]. J Food Prot, 1993, 50(4): 338-356.

[13] DIMITRIS V, EUGENIA B, CHRISA V, et al. Survey of probiotic enterococci from traditional dairy products and their impact upon the infant intestinal microbiota[J]. The Journal of General and Applied Microbiology, 2009, 55(4): 311-315.

[14] O’SULLIVAN L, ROSS R P, HILL C. Potential of bacteriocinproducing lactic acid bacteria for improvements in food safety and quality[J]. Biochimie, 2002, 84(5/6): 593-604.

[15] LISBOA M P, BONATTO D, BIZANI D, et al. Characterization of a bacteriocin-like substance produced by Bacillus amyloliquefaciens isolated from the Brazilian Atlantic forest[J]. Int Microbiol, 2006, 9(2): 111-118.

Biological Characteristics of Bacteriocin Produced by Lactococcus lactis subsp. cremoris

TANG Chun-mei1，CHEN Jun-liang2，REN Guang-yue2
(1. College of Animal Science and Technology, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China；2. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

A bacteriocin-producing lactic acid bacteria strain was isolated from traditional dairy products in Inner Mongolia, and was identif i ed as Lactococcus. lactis subsp. cremoris KLDS 4.0326. Bacteriocin produced by KLDS 4.0326 was partially purif i ed and its characteristics were also preliminarily studied. The cell-free fermentation supernatant of strain KLDS 4.0326 with the exception of interferences from acidic products and hydrogen peroxide had potent inhibitory effects on both Grampositive bacteria (Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis) and Gram-negative bacteria (Escherichia coli and Salmonella). After treatment with trypsin, pepsin, papain or proteinase K, its inhibitory activity decreased, indicating that the antibacterial component was protein. This bacteriocin showed good thermal stability and stable antibacterial activity under acidic conditions, and had a broad antibacterial spectrum against various species of Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria.

Lactococcus lactis；bacteriocin；biological characteristics

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0248-04

2011-09-30

唐春梅(1971ü)，女，副教授，碩士，主要從事動物產品研究。E-mail：yanlei199881@163.com