北京烤鴨加工過程中菌相變化規律及其特征

任 琳，趙 冰，趙 燕，陳文華，李家鵬，榮 慧，張春江，喬曉玲*

(中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068)

北京烤鴨加工過程中菌相變化規律及其特征

任 琳，趙 冰，趙 燕，陳文華，李家鵬，榮 慧，張春江，喬曉玲*

(中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068)

應用微生物選擇性培養并結合細菌系統鑒定的方法對北京烤鴨加工過程中的菌相變化規律及其特征進行分析和研究。結果顯示：乳酸菌是整個加工過程中的主要微生物為3.41～5.97(lg(CFU/g))，受溫度影響較小；假單胞菌屬在加工前期(解凍、清洗)分別是4.77(lg(CFU/g))和4.39(lg(CFU/g))，為僅次于乳酸菌的主要微生物，受溫度影響較大；腸桿菌科在加工中期(燙皮、晾掛)與乳酸菌達到相同數量級分別是3.18(lg(CFU/g))和5.96(lg(CFU/g))，成為僅次于乳酸菌的主要微生物。烤鴨的燙皮、烤制工序能有效降低各類菌的含量，滅菌后菌含量低于1.00(lg(CFU/g))；晾掛工序是整個加工過程中微生物出現增長的階段，各類菌的數值在4.29～6.36(lg(CFU/g))，因此需嚴格控制晾掛的溫度、濕度和時間，以確保產品的安全性。本研究表明，乳酸菌、假單胞菌屬和腸桿菌科是北京烤鴨加工過程中的主要微生物。

菌相變化；選擇性培養；鑒定；北京烤鴨

烤鴨是我國熏燒焙烤肉制品的典型代表之一，根據加工工藝的不同，主要分為掛爐烤鴨和燜爐烤鴨兩大類[1]。全國各地都有烤鴨的制作方法[2-4]，其中北京烤鴨由于其鮮嫩適度、肥瘦分明、味道醇厚蜚聲海內外，深受消費者喜愛[5]。2011年北京出現的黑心烤鴨事件[6]引起了社會的廣泛關注。由于肉制品的品質變化可以由不同的原料選擇、生產工藝以及微生物菌相等多種內外因素共同作用引發[7]，原料肉中的初始微生物由許多種構成[8]，而微生物是造成安全隱患的重要因素之一。因此，了解和研究烤鴨從原料到成品的加工過程中菌相的變化規律是保證產品質量安全以及改良烤鴨品質的基礎。

目前，國內有冷卻肉[9-11]、臘肉[12]和塊狀火腿[13]加工過程以及燒雞[14]、鹽水鴨[15]和低溫熏煮香腸[16]等肉制品貯藏過程中腐敗微生物初始菌相及其變化規律的研究。但針對熏燒焙烤肉制品如烤鴨產品的研究主要集中在烤鴨的制作工藝[2-4]、風味[17-18]以及有害物檢測[19-20]等方面，而貫穿其從原料到成品加工過程中菌相變化規律的分析和鑒定還尚未有相關深入的研究。因此，本實驗通過對北京烤鴨加工過程中菌相變化規律的分析及其特征研究，為進一步改善烤鴨加工工藝、延長產品貨架期、制修定烤鴨產品的風險評估、標準和操作規范提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

北京烤鴨由中國肉類食品綜合研究中心實驗廠車間當天生產的，取樣后立即進行菌相分析。

革蘭氏染液、1%鹽酸二甲基對苯二胺、10%過氧化氫、凡士林、液體石蠟(均為分析純) 北京化學試劑公司。

平板計數瓊脂、MRS培養基、MSA瓊脂、VRBD瓊脂、PSA培養基、孟加拉紅培養基、休和利夫森二氏Hugh-Leifson培養基(O/F培養基)、索恩利Thornley培養基北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

202A-0恒溫干燥箱 上海和盛有限公司；SL502N型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；生物安全柜 新加坡Esco公司；BH-2型生物顯微鏡 日本Olympus公司；F1-45型恒溫培養箱、G154DWS濕熱滅菌鍋、FSP-625型干熱滅菌箱 日本三洋公司；pH計 德國Ebro公司。

1.3 方法

烤鴨加工工藝流程：原料解凍→清洗→燙皮→晾掛→烤制→真空包裝→滅菌。

主要參數：解凍5℃，清洗8℃，燙皮100℃、2s；晾掛，先4℃，14h，再18℃，3h；烤制150℃，30min；滅菌121℃，40min。

將烤鴨的每一步加工工藝作為取樣點，樣品處理方法參照GB/T 4789.2ü2010《食品衛生微生物學檢驗 菌落總數測定》[21]。

菌相變化分析：采用選擇性培養基對烤鴨加工過程中的細菌總數、乳酸菌、葡萄球菌和微球菌、腸桿菌科、假單胞菌屬以及酵母和霉菌進行平板計數。具體培養基和培養條件如表1所示。

表 1 北京烤鴨加工過程中各類菌的培養基及培養條件Table 1 Selective media and incubation conditions used for bacterial isolation from Beijing roast duck

主要微生物的分離：從烤鴨加工過程中主要微生物的選擇性培養基上挑取特征典型的菌落，進行反復劃線分離，得到純化的單菌落。

主要微生物的特征分析與初步鑒定：觀察并詳細記錄已分離純化的單個菌落的大小、形態、隆起程度、邊緣結構、表面形態、光澤度、透明度、質地及顏色等菌落形態特征；挑取菌落進行革蘭氏染色，觀察并描述各類菌的細胞形狀、胞間排列方式等；進行生長溫度、耐鹽性、氧化酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化發酵和精氨酸雙水解等生理生化實驗，根據Brown[22]推薦的肉品中微生物鑒定圖譜，并結合《常見細菌系統鑒定手冊》[23]鑒定主要微生物的科和屬。

2 結果與分析

2.1 烤鴨加工過程中的菌相變化分析

圖 1 北京烤鴨加工過程中的菌相變化規律Fig.1 Microf l ora variation in Beijing roast duck during processing

由圖1可知，各種菌的變化趨勢基本一致。經過清洗和燙皮工序后，各種菌逐漸減少，數值在2.24～5.11(lg(CFU/g))；晾掛后，各種菌數值上升，為4.29～6.36(lg(CFU/g))；經過烤制后，各種菌數大幅下降，在0.70～3.57(lg(CFU/g))；滅菌后，菌數低于1.00(lg(CFU/g))。其中，在燙皮、烤制和滅菌步驟中，各目標菌的數值降低，這是由于在這些加工工序中，溫度均達到100℃及以上，分別是100、150、121℃。較高溫度使得微生物中的蛋白質發生變性，一些酶失活[24]，從而可以有效殺死各類菌。而晾掛工序使得各目標菌的數值上升，是由于晾掛工序中的相對濕度為80%～90%，在本實驗所取的樣品生產過程中為達到烤鴨表皮干燥的效果，需要在4℃和18℃的條件下晾掛14～17h。由于肉制品的菌相變化與水分含量和水分活度的變化息息相關，相關性在95%以上[25]。因此，較大的相對濕度以及較長的操作時間有利于各類菌的生長繁殖，這可能是造成晾掛工序中各類菌數值升高的原因。

另外，從圖1中還可以看出：在解凍、清洗、燙皮、晾掛和烤制過程中，細菌總數在3.57～6.36(lg(CFU/g))，滅菌后細菌總數＜1.00(lg(CFU/g))。目前在食品工業中，熱處理仍然是最簡便易行的殺菌方法之一[26-28]。烤鴨的滅菌采用的是高溫高壓(121℃，40min)滅菌方式，食品經過高溫高壓滅菌后雖然不能殺死其中的全部微生物，但卻可以大大降低產品初始細菌總數，達到商業無菌狀態，從而延長產品的貨架期[29]。乳酸菌在烤鴨加工過程中是3.41～5.97(lg(CFU/g))，為加工過程中的主要微生物。這是由于乳酸菌在有氧和低氧條件下均可良好生長，而且乳酸菌在其生長繁殖的過程中可導致微生物生長環境中的pH值降低，并產生一些如乳桿菌素(lactocidin)等物質，對其他微生物的生長和繁殖具有抑制作用[30]。另外，實驗數據顯示滅菌后仍有含量低于1.00(lg(CFU/g))的乳酸菌存活，這可能是由于乳酸菌具有良好的耐溫性[16]，同時這也提示，對于產品熱加工時應予以特別注意以及開發針對乳酸菌的抑制技術。假單胞菌屬在加工前期的解凍和清洗過程中分別是4.77(lg(CFU/g))和4.39(lg(CFU/g))，是僅次于乳酸菌的主要微生物，燙皮后降為2.80(lg(CFU/g))，烤制后菌落總數＜1.00(lg(CFU/g))，滅菌后未檢出。這顯示，假單胞菌屬的生長和存活狀況受溫度影響較大。由于假單胞菌屬在有氧和較低溫度條件下，生長速率具有明顯優勢[31]，在烤鴨生產過程中原料的解凍和清洗分別在5℃和8℃條件下進行，因此較低的溫度有利于假單胞菌屬的生長，這和大部分研究結果顯示的假單胞菌屬是引起冷卻肉腐敗的主要微生物結論一致[32-35]。腸桿菌科在加工中期的燙皮和晾掛過程中分別增加到3.18(lg(CFU/g))和5.96(lg(CFU/g))，成為僅次于乳酸菌的主要微生物，烤制后＜1.00(lg(CFU/g))，滅菌后未檢出。這是由于在適宜的環境條件下，腸桿菌科會富集，同樣具有很強的致腐能力并產生含有胺類物質的異味[36]。因此，應對晾掛工序中的溫度、濕度和操作時間予以嚴格控制，以確保食品的食用安全性。葡萄球菌和微球菌以及酵母菌和霉菌在解凍、清洗、燙皮、晾掛和烤制過程中為2.22～4.94(lg(CFU/g))，滅菌后均未檢出。因此，葡萄球菌和微球菌以及酵母菌和霉菌不是烤鴨生產過程中的主要微生物。

2.2 主要微生物的特征研究

對來源于MRS、PSA和VRBD選擇性培養基平板上的典型菌落進行劃線分離，將得到的純化菌落進行初步鑒定。表2為北京烤鴨加工過程中主要微生物的初步鑒定結果：M-1為革蘭氏陽性、桿狀、氧化酶和接觸酶皆陰性、41℃和5% NaCl條件下均能良好生長的細菌；M-2為革蘭氏陽性、氧化酶和接觸酶皆陰性、30℃生長良好、5% NaCl不能生長的球菌；P-1和P-2是革蘭氏陰性、短桿、氧化酶陽性、接觸酶陽性、葡萄糖氧化產酸型細菌；V-1為革蘭氏陰性、桿狀、氧化酶陰性、葡萄糖發酵產酸型細菌。根據Brown[22]推薦的肉品中微生物鑒定圖譜，并結合《常見細菌系統鑒定手冊》[23]初步鑒定M-1為乳桿菌屬(Lactobacillus)，M-2為乳球菌屬(Lactococcus)，P-1、P-2為假單胞菌屬(Pseudomonas)，V-1為腸桿菌科(Enterbacteriaceae)。

以上給出的是各選擇性培養基平板上典型菌落的初步鑒定結果，其他菌落的鑒定結果未列出。從初步鑒定結果可以進一步說明乳酸菌、假單胞菌屬和腸桿菌科細菌是北京烤鴨加工過程中的主要微生物。另外，如需對北京烤鴨生產過程中主要微生物進行更精確的菌種分析和鑒別，則需進行碳源實驗[10]并結合分子生物學方法進行。目前，16S rRNA基因克隆和序列分析的方法正在被應用于對冷卻肉的微生物菌相分析的實驗中[37-38]。因此，利用16S rRNA基因克隆和序列分析以及碳源實驗等方法對烤鴨加工過程中主要微生物進行菌種鑒別需要進一步的實驗研究。

表 2 北京烤鴨加工過程中主要微生物的初步鑒定結果Table 2Results of primary identif i cation of dominant microorganisms in Beijing roast duck

3 結 論

實驗通過對北京烤鴨加工過程中菌相變化規律的分析及其特征的研究得到：在烤鴨加工過程中，各種菌的變化趨勢基本一致，其中乳酸菌是烤鴨加工過程中的主要微生物，為3.41～5.97(lg(CFU/g))；假單胞菌屬和腸桿菌科分別為加工前期(解凍、清洗)和加工中期(燙皮、晾掛)僅次于乳酸菌的主要微生物，分別達到4.77、4.39、3.18、5.96(lg(CFU/g))。另外，在燙皮、烤制以及滅菌步驟中，各目標菌的數值降低，其中受溫度影響最大和最小的菌群分別是假單胞菌屬和乳酸菌；而晾掛工序中，在4℃和18℃的條件下，較大的相對濕度(80%～90%)以及較長的操作時間(14～17h)，可能是導致各類菌增加的原因。

[1] 趙霖, 鮑善芬, 宋曙輝, 等. “蔬香酥烤鴨”與普通燜爐烤鴨營養成分的研究[J]. 中國食品學報, 2009, 9(3): 174-179.

[2] 謝文鋒, 喻長春, 陳丹, 等. 大瀛風香鴨的研制[J]. 肉類工業, 2002(7): 19-21.

[3] 倪洪錦. 常溫風味烤鴨的加工工藝研究[J]. 中國食品學報, 2012(2): 16-18.

[4] 劉衛民. 如何制作川式掛爐烤鴨[J]. 四川烹飪, 2005(6): 29-30.

[5] 張超, 施建輝. 關于北京烤鴨工藝特點及創新的研究[J]. 廣州食品工業科技, 2004(3): 86-88.

[6] 馮華. “黑心烤鴨”的判決是一大進步[N]. 中國食品安全報: 中國食品質量報, 2011-11-23(2).

[7] ARRAGE A A, PHELPS T J, BENOIT R E, et al. Survival of subsurface microorganisms exposed to UV radiation and hydrogen peroxide[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(11): 3545-3550.

[8] JACKSON T C, ACUFF G R, VANDERZANT C. Identif i cation and evaluation of volatile compounds of vacuum and modif i ed atmosphere package beef strip loins[J]. Meat Science, 1992, 31: 175-190.

[9] 傅鵬, 李平蘭. 冷卻豬肉初始菌相分析與冷藏過程中的菌相變化規律研究[J]. 食品科學, 2006, 27(11): 119-124.

[10] 陳亞莉. 冷卻豬肉菌相分析以及生物保鮮劑的篩選[D]. 長沙: 湖南農業大學, 2010.

[11] 馬儷珍, 南慶賢, 戴瑞彤. 冷卻豬肉中腐敗菌的分離、初步鑒定與初始菌相分析[J]. 天津農學院學報, 2005, 12(3): 39-43.

[12] 劉洋. 臘肉加工和貯藏期間菌相變化和理化變化[D]. 北京: 中國農業大學, 2005.

[13] 董盛月, 梁鋒, 趙一楠, 等. 塊狀火腿生產過程中的菌相及理化變化[J]. 食品科學, 2009, 30(19): 96-99.

[14] 郭光平. 燒雞腐敗菌菌相分析及保鮮技術的研究[D]. 煙臺: 煙臺大學, 2011.

[15] 李艷亮, 金邦荃, 劉芳, 等. 冷藏條件下鹽水鴨菌相消長規律研究[J].食品工業科技, 2010, 31(8): 157-159.

[16] 張春江, 羅欣, 王海燕. 低溫熏煮香腸的菌相分析及腐敗菌的分離[J]. 肉類工業, 2004(4): 25-28.

[17] 馬家津, 呂躍鋼, 張文. 北京烤鴨香味分析[J]. 北京工商大學學報:自然科學版, 2006, 24(2): 1-4.

[18] 陳耿俊, 宋煥祿, 何潔, 等. 北京烤鴨香味氣相指紋圖譜技術研究初探[J]. 食品工業科技, 2008, 29(11): 108-111.

[19] 廖倩, 高振江, 張世湘, 等. 高效液相熒光法測定“北京烤鴨”鴨皮中的多環芳烴[J]. 食品科學, 2009, 30(10): 149-152.

[20] 姜新杰, 高振江, 楊文俠, 等. 高效液相色譜法測定“北京烤鴨”中多環芳烴含量的研究[J]. 現代生物醫學進展, 2007, 7(11): 1612-1614.

[21] GB/T 4789.2ü2010 食品衛生微生物學 檢驗菌落總數測定[S]. 2010.

[22] BROWN M H. Meat microbiology[M]. London, New York: Applied Science Publishers Ltd., 1982: 474-475.

[23] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2001: 66-294.

[24] 錢存柔, 黃儀秀. 微生物學實驗教程[M]. 北京: 北京大學出版社, 1999: 61-224.

[25] 劉洋, 崔建云, 任發政, 等. 低鹽臘肉在加工過程中的菌相變化初探[J]. 食品工業科技, 2005, 26(8): 49-53.

[26] von HOLY A, MEISSNER D, HOLZAPFEL W H. Effects of pasteurization and storage temperature on vacuum-packaged Vienna sausage shelf life[J]. S Afr J Sci, 1991, 87: 387-390.

[27] 孫承鋒, 戴瑞彤, 南慶賢. 低溫殺菌對真空包裝醬牛肉貨架期及品質的影響[J]. 食品科技, 2003(3): 21-24.

[28] 康懷彬, 肖楓, 徐幸蓮. 二次殺菌方式對燒雞保質期影響的研究[J].食品科學, 2007, 28(7): 174-177.

[29] GARRIGA M, GRèBOL N, AYMERICH M T, et al. Microbial inactivation after high-pressure processing at 600 MPa in commercial meat products over its shelf life[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2004, 5(4): 451-457.

[30] SAMELI J, KAKOURI A, REMENTZIS J. Selective effect of the product type and the packaging conditions on the species of lactic acid bacteria dominating the spoilage microbial association of cooked meats at 4 ℃[J]. Food Microbiology, 2000, 17(3): 329-340.

[31] GILL C O, NEWTON K G. The ecology of bacterial spoilage of fresh meat at chill temperatures[J]. Meat Science, 1978, 2: 21.

[32] von HOLY A, CLOETE T E, HOLZAPFEL W H. Quantification and character-ization of microbia lpopulations associated with spoiled,vacuum-packed Vienna sausages[J]. Food Microbiology, 1991, 8(2): 95-104.

[33] von HOLY A, HOLZAPFEL W H, DYKES G A. Bacterial populations associated with Vienna sausage packaging[J]. Food Microbiology, 1992, 9: 45-53.

[34] DYKES G A, MARSHALL L A, MEISSNER D, et al. Acid treatment and pasteur-ization affect the shelf life and spoilage ecology of vacuum-packaged Vienna sausages[J]. Food Microbiology, 1996, 13: 69-74.

[35] FRANZ C M A P, von HOLY A. Bacterial populations associated with pasteurized vacuum-packed Vienna sausages[J]. Food Microbiology, 1996, 13: 165-174.

[36] McMEEKIN T A. Microbial spoilage of meats[M]//DAVIES R. Developments in food microbiology: Vol 1. London: Applied Science Publishers, 1982: 1-40.

[37] OLSSON C, AHRNE S, PETTERSSON B, et al. The bacterial of fresh and chill-stored pork: anlysis by cloning and sequencing of 16S rRNA genes[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 83: 245-252.

[38] 孫彥雨, 周光宏, 徐幸蓮. 冰鮮雞肉貯藏過程中微生物菌相變化分析[J]. 食品科學, 2011, 32(11): 146-151.

Microf l ora Variation and Characteristics of Beijing Roast Duck during Processing

REN Lin，ZHAO Bing，ZHAO Yan，CHEN Wen-hua，LI Jia-peng，RONG Hui，ZHANG Chun-jiang，QIAO Xiao-ling*
(China Meat Research Center, Beijing 100068, China)

The microflora variation and characteristics of Beijing roast duck at different stages of production were analyzed by the traditional selective culture and microf l ora systematic identif i cation. The results indicated that lactic acid bacteria were the most dominant microorganisms during the entire process (3.41ü5.97 (lg(CFU/g)) and inf l uenced little by temperature followed by Pseudomonas spp. during the early stages (thawing and cleaning), which was greatly inf l uenced by temperature, or Enterbacteriaceae spp., which reached the same order of magnitude as lactic acid bacteria (3.18 (lg(CFU/g)) and 5.96 (lg(CFU/g)), respectively) during the middle stages (skin blanching and natural air drying). The populations of various bacterial species declined to a level lower than 1.00 (lg(CFU/g)) during skin blanching and roasting. Bacterial growth was observed only at the stage of natural air drying during the whole production process, and the populations of various bacterial species ranged from 4.29 to 6.36 (lg(CFU/g)). Accordingly, temperature, humidity and drying time should be strictly controlled to ensure food safety. This study demonstrates that lactic acid bacteria, Pseudomonas spp. and Enterbacteriaceae spp. are dominant in Beijing roast duck during various stages of processing.

microf l ora variation；traditional selective culture；identif i cation；Beijing roast duck

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0281-04

2012-08-28

國家質量監督檢驗檢疫總局質檢公益性行業科研專項(201110209)

任琳(1981ü)，女，工程師，碩士，研究方向為肉類食品安全。E-mail：renlin7684@sina.com

*通信作者：喬曉玲(1964ü)，女，教授級高工，本科，研究方向為肉品加工技術。E-mail：cmrcsen@126.com