羊肚菌發酵產物功能性研究

呂曉蓮，郭 宏，賈建會，陶國琴，彭義交，郭鴻源，曹 煒，徐增慧，田 旭

(1.北京市食品研究所，北京 100162；2.北京食品科學研究院，北京 100068)

羊肚菌發酵產物功能性研究

呂曉蓮1，郭 宏1，賈建會1，陶國琴2，彭義交1，郭鴻源1，曹 煒1，徐增慧1，田 旭1

(1.北京市食品研究所，北京 100162；2.北京食品科學研究院，北京 100068)

目的：羊肚菌是一種珍稀食(藥)用真菌，具有極高的營養和藥用價值。本實驗對羊肚菌液體發酵產物對小鼠免疫功能和抗輻射功能的影響進行研究，為該產品開發應用提供依據。方法：按照衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)中的檢驗方法，對小鼠進行細胞免疫功能和單核-巨噬細胞功能實驗以研究其增強免疫力功能；通過外周血白細胞計數實驗、骨髓細胞DNA含量實驗和小鼠骨髓細胞微核實驗，研究其抗輻射功能。結果：羊肚菌發酵產物具有增強免疫功能的作用及對有對輻射危害有輔助保護功能的作用。結論：羊肚菌發酵產物具備開發成增強免疫及抗輻射方面保健品的潛力。

羊肚菌；發酵；增強免疫；抗輻射

羊肚菌(Morchella)隸屬子囊菌亞門(Ascomycotina)、盤菌綱(Discornycetes)、盤菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)[1]，它是世界公認的一種珍貴、稀有的食(藥)用真菌[2]。羊肚菌具有非常高的營養價值，張廣倫等[3]對新疆產粗柄羊肚菌子實體的營養成分進行了測定，結果表明羊肚菌子實體中含有蛋白質22.06%，粗脂肪3.82%，碳水化合物40.00%。與子實體相比，發酵所得到的羊肚菌菌絲體同樣具有很高的營養價值，并且菌絲體中必需氨基酸超過了子實體的含量[4-6]。

此外羊肚菌還具有較高的保健和藥用價值，早在《本草綱目》中就記載了它具有助消化、補腎、補腦等功效。現代醫學研究還表明，羊肚菌含有多種活性物質，Tomita[7]從羊肚菌中提純分離得到血小板集落抑制因子；Iwahara[8]、Saegusa[9]等從羊肚菌中獲得黑色素形成抑制劑；Cavazzoni[10]、Moriguchi等[11]研究還顯示羊肚菌具有較強的纖維素酶和谷氨酰轉肽酶活性；大量研究還表明，羊肚菌中最重要的生物活性物質為羊肚菌多糖，它具有調節免疫、抗疲勞、降血脂、抗腫瘤等作用，并能減輕癌癥患者放化療引起的毒副反應[12]；Duncan等[13]從羊肚菌子實體中分離出了一種分子質量為106D的半乳甘露聚糖，具有提高巨噬細胞吞噬能力、提高人體免疫力的功效。

本項目組經多年研究，優化了羊肚菌液體發酵培養基和發酵工藝條件，確定發酵產物的主要功效成分為羊肚菌粗多糖[14]。另外，相關研究也表明通過液體發酵獲得的羊肚菌多糖同樣具有生物活性，如陳彥等[15]通過對羊肚菌發酵液胞外多糖藥理活性的研究表明，羊肚菌胞外多糖(EPM)高、低兩個劑量均能顯著抑制S-180腫瘤的生長；Nitha等[16]研究表明羊肚菌菌絲體乙醇水溶液提取物具有抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤的作用；Mau等[17]研究發現羊肚菌菌絲體甲醇提取物具有抗氧化的作用；贠建民[18]研究表明羊肚菌發酵液在提高機體對運動負荷的適應能力、抵抗疲勞的產生和加速疲勞消除方面具有明顯作用；張利平等[19]研究表明發酵羊肚菌多糖可以顯著增強小鼠的非特異性免疫及細胞免疫；孫玉軍等[20]研究表明發酵羊肚菌胞內多糖對小鼠肝臟的損傷有保護作用。但到目前為止，尚未發現羊肚菌子實體和羊肚菌液體發酵產物具有抗輻射作用的相關研究報道。

本實驗按照衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)中的增強免疫力功能和對輻射危害有輔助保護功能檢驗方法，研究羊肚菌液體發酵產物對小鼠免疫功能和抗輻射作用的影響，為開發保健食品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌菌種(Morchella esculenta(L.)Pers)，購自河南省微生物研究所；10oBx的羊肚菌發酵產物，中試實驗制備；補體(豚鼠血清)、SA緩沖液、印度墨汁、都氏試劑、Hank’s液 上海撫生實業有限公司；小牛血清上海酶聯生物科技有限公司；綿羊紅細胞(SRBC) 鄭州百基生物技術有限公司；Gimesa染液 南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物

選用1月齡清潔級昆明種小鼠，雌性，體質量19～24g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，合格證號：SXXK-(軍)2002-001。動物實驗室合格證號：SYXK(京)2002-0022。

1.3 儀器與設備

BIOSTAT?E小型發酵罐 德國貝朗國際生物工程公司；LABOROTA 4000旋轉蒸發器 德國Heidolph公司；DL-CJ-IND超級潔凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；754分光光度計、TDL-5-A高速離心機上海安亭科學儀器廠；游標卡尺(精密度0.02mm) 北京精益恒源量具有限公司；FA2004電子天平 上海天平儀器廠；MEK-6318K全自動血球計數儀 上海東湖儀器試劑科技有限責任公司；Plus384酶聯免疫光譜分析儀美谷分子儀器(上海)有限公司；鈷源 北京大學醫學部鈷源室。

1.4 方法

1.4.1 羊肚菌發酵產物制備

圖 1 羊肚菌液體發酵工藝流程圖Fig.1 Procedure for preparation of fermentation products from Morchella

原料處理及配料：將大麥芽粉碎后，按1:10(m/V)加水攪拌，37℃保持20min，再升溫至65℃保持1.5h左右，糖化至加碘溶液不顯藍色為止，再升至95℃保持10min滅酶，以4層紗布過濾，糖化成6oBx麥芽汁后取4L加入液體培養基中；稱90g大豆粉按1:20(m/V)加水攪拌，再加入0.04%中性蛋白酶，45℃保持2h后，再升至95℃保持10min滅酶，用4層紗布過濾，加入液體培養基中；稱50g紅茶粉碎后，按1:20加水攪拌，90℃保持45min，用4層紗布過濾，加入液體培養基中；再加入300g蜂蜜，加水至10L。

發酵罐及培養基滅菌條件：發酵罐115℃，20min；培養基121℃，30min。然后將滅菌后培養基降至28℃。

接種：把原菌種按無菌操作接種在斜面培養基上，置28℃培養箱培養72h，取斜面菌種約5mm2菌膜接種在液體發酵培養基中，置28℃旋轉振蕩培養，60r/min培養72h作為Ⅰ級搖瓶菌種，Ⅰ級菌種液按2%接種量接種在液體發酵培養基中，置28℃旋轉振蕩培養，60r/min培養72h為Ⅱ級搖瓶菌種，將Ⅱ級搖瓶菌種2%接種到小發酵罐中，28℃培養72h，溶解氧量80%，控制 pH值為6.6。

菌絲體處理：將菌絲體加3倍水經膠體磨磨碎，90℃浸提150min。

濃縮：將合并濾液濃縮用旋轉蒸發器進行濃縮至10oBx，得到羊肚菌液體發酵產物，羊肚菌粗多糖含量≥220mg/100mL。

1.4.2 劑量選擇與受試液給予方式

經前期預實驗表明，羊肚菌粗多糖含量為2.75mg/kg (以體質量計)時即有一定的生物活性。因此，建議人體推薦攝入量為：75mL/(人gd)(以人體質量60kg計，即1.25mL/kg)。

按增強免疫功能和輻射危害有輔助保護功能檢驗方法要求，分別設計3個實驗組和1個對照組，3個實驗組給予受試液的量分別是人體推薦攝入量的30、10倍和1倍。具體如下：

將羊肚菌發酵產物濃縮至67oBx，取該濃縮液56mL加去離子水至100mL，混勻作為實驗組3(即37.5mL/kg (以體質量計)，人體推薦攝入量的30倍)的受試液；再將實驗組3的受試液分別稀釋3倍和30倍，作為實驗組2(即12.5mL/kg，人體推薦攝入量的10倍)和實驗組1(1.25mL/kg，人體推薦攝入量)的受試液。各組均按0.1mL/10g經口灌胃，對照組小鼠給予去離子水。各組均喂以基礎飼料飼養。

1.4.3 動物實驗方法

小鼠檢疫3d，未見異常，可用于實驗。

將96只小鼠分成兩批進行增強免疫功能實驗，每批48只，一批用于細胞免疫功能ü ü遲發型變態反應(DTH)實驗，一批用于單核-巨噬細胞功能üü小鼠碳廓清實驗。將每批小鼠再隨機分為4組，每組12只分籠飼養，按實驗劑量每天灌胃1次，連續30d，于第30天給予受試液后對小鼠進行各項免疫指標測定。

將80只小鼠分成兩批進行對輻射危害有輔助保護功能實驗，每批40只，一批用于外周血白細胞計數(WBC)實驗，另一批用于小鼠骨髓細胞微核實驗和骨髓細胞DNA含量實驗。將每批再隨機分成4組，每組10只分籠飼養，按實驗劑量每天灌胃1次。

1.4.3.1 DTH測定(足跖增厚法)

于第30天給予受試液后，給每組12只小鼠腹腔注射體積分數2%的綿羊紅細胞(SRBC)，每只注射0.2mL(約1h108個SRBC)。4d后測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射體積分數20% SRBC進行攻擊，每只注射0.02mL(約1h108個SRBC)，注射后24h分別測量左后足跖部厚度，計算攻擊前、后的差值。

1.4.3.2 小鼠碳廓清實驗

于第30天給予受試液后，給每組12只小鼠尾靜脈注射0.2mL用生理鹽水稀釋5倍的印度墨汁。待墨汁注入2min和10min后分別從內眥靜脈叢取血20μL，加到2mL 0.1% Na2CO3溶液中，在600nm波長處測光密度(OD600nm)，以Na2CO3溶液作空白對照。再將小鼠處死，取肝臟和脾臟稱質量，計算吞噬指數(α)。

式中：OD1、OD2分別表示墨汁注入2min和10min測定的光密度值；t1、t2分別為2min和10min。

1.4.3.3 白細胞總數(WBC)實驗

連續40d給予受試液，在給予受試液的第27天時給各組小鼠均用5Gy Co60-γ射線全身照射1次。分別于照射前、照射后第3天和照射后第14天取尾血20μL，加到0.38mL 0.1%鹽酸中，混勻后加入血球計數板中，計算計數池中4個大方格中WBC，并分別比較輻射前、輻射后第3天和輻射后第14天對輻射組和各實驗組WBC總數的變化。

1.4.3.4 小鼠骨髓細胞微核實驗和骨髓細胞DNA含量實驗

連續30d給予受試液，在給予受試液的第27天時給各組小鼠均用5Gy Co60-γ射線全身照射1次。于照射后第3天頸椎脫臼處死小鼠，常規取胸骨，用小牛血清沖洗胸骨骨髓腔制成細胞懸液涂片，涂片自然干燥后，放入甲醇中固定5～10min，放入Gimesa應用液中，染色5～10min，立即用磷酸鹽緩沖液沖洗，晾干，油鏡下對每只小鼠觀察1000個嗜多染紅細胞，計算含微核細胞數及微核細胞率，微核率以千分率表示。剝離出股骨，取1mL Hank’s液，沖出股骨中的全部骨髓細胞，混勻后用酶聯免疫光譜分析儀于波長260nm處測定骨髓細胞DNA含量。核酸的最大吸收波長為260nm，在波長260nm時，OD260nm值為1相當于DNA質量濃度50μg/mL。

1.4.3.5 數據統計

2 結果與分析

2.1 羊肚菌發酵產物對小鼠DTH的影響

綿羊紅細胞(SRBC)刺激T淋巴細胞增殖成為致敏淋巴細胞，攻擊部位出現腫脹的程度反映了遲發型變態反應程度。測量結果見表1。由表1可知，實驗組2和實驗組3的小鼠足跖厚度增加明顯差異具有顯著性或極顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，說明羊肚菌發酵產物具有細胞免疫功能。

表 1 羊肚菌發酵產物對小鼠DTH的影響(±s,n＝12)Table 1 Effect of Morchella fermentation products on DTH of rats (±s,n＝12)

表 1 羊肚菌發酵產物對小鼠DTH的影響(±s,n＝12)Table 1 Effect of Morchella fermentation products on DTH of rats (±s,n＝12)

注：*. 與陰性對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)；**. 與陽性對照組比較有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

組別足跖增加厚度/mmP值實驗組10.24f0.090.272實驗組20.28f0.06*0.027實驗組30.29f0.09**0.008陰性對照組0.20f0.06

2.2 羊肚菌發酵產物對小鼠碳廓清能力的影響

表 2 羊肚菌發酵產物對小鼠碳廓清能力的影響(x±s,n＝12)Table 2 Effect of Morchella fermentation products on carbon clearance capacity of rats (x±s,n＝12)

由表2可知，實驗組2和實驗組3的小鼠碳廓清能力明顯升高，與對照組相比差異具有顯著性或極顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，說明羊肚菌發酵產物具有單核-巨噬細胞功能。

2.3 小鼠輻射模型成立檢驗

表 3 小鼠輻射模型對照組輻射前后白細胞總數自身比較(±s,n＝12)Table 3 Comparison of rat model control group before and after irradiations, n＝12)

表 3 小鼠輻射模型對照組輻射前后白細胞總數自身比較(±s,n＝12)Table 3 Comparison of rat model control group before and after irradiations, n＝12)

輻射模型對照組白細胞總數/(109/L)F值P值輻射前12.73f2.10輻射后第3天1.38f0.35280.30.000

由表3可知，與輻射前相比較，輻射后第3天輻射模型對照組的白細胞總數急劇下降，差異具有極顯著性，F值為280.3，P值為0.000，說明輻射損傷對照組成立，可以進行相應的功能實驗。

2.4 羊肚菌發酵產物對WBC計數的影響

表 4 羊肚菌發酵產物對WBC計數的影響(±s,n＝10)Table 4 Effect of Morchella fermentation products on WBC of rats (±s,n＝10)

表 4 羊肚菌發酵產物對WBC計數的影響(±s,n＝10)Table 4 Effect of Morchella fermentation products on WBC of rats (±s,n＝10)

注：*.與輻射模型對照組相雙有顯著性差異(P＜0.05)；**.與輻射模型對照組相比有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

組別輻射前輻射后第3天輻射后第14天實驗組112.68f 1.871.62f 0.452.19f 0.41實驗組212.59f 2.051.87f 0.35**2.49f 0.41*實驗組312.75f 1.801.97f 0.34**2.54f 0.43**輻射模型對照組12.73f 2.111.38f 0.352.01f 0.40

由表4可知，輻射前各實驗組與輻射模型對照組的WBC總數比較，差異無顯著性，可以進行照射和后續實驗。輻射后第3天和輻射后第14天各實驗組的WBC總數均高于輻射模型對照組，其中實驗組2和實驗組3的WBC總數與輻射模型對照組相比，白細胞總數明顯增多，差異具有顯著性或極顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，說明羊肚菌發酵產物具有抗輻射損傷的功能，可降低血液系統受損程度。

2.5 羊肚菌發酵產物對小鼠骨髓細胞微核實驗和骨髓細胞DNA含量的影響

表 5 羊肚菌發酵產物對小鼠骨髓細胞微核實驗和骨髓細胞DNA含量的影響(±s,n＝10)Table 5 Effect of Morchella fermentation products on bone marrow cell micronucleus and DNA content of myeloma cells in mice(±s,n＝10)

表 5 羊肚菌發酵產物對小鼠骨髓細胞微核實驗和骨髓細胞DNA含量的影響(±s,n＝10)Table 5 Effect of Morchella fermentation products on bone marrow cell micronucleus and DNA content of myeloma cells in mice(±s,n＝10)

組別觀察嗜多染紅細胞數含微核細胞數細胞微核率/骨髓細胞DNA含量(OD600nm值)實驗組110h100011.4f2.411.42.39f0.87實驗組210h100011.2f1.811.2*3.45f1.31實驗組310h100010.8f2.410.8*4.10f2.12*輻射模型對照組10h100013.8f3.913.82.38f0.78

由表5可知，照射后第3天，各實驗組小鼠骨髓細胞微核率明顯低于輻射模型對照組，其中實驗組2和實驗組3的小鼠骨髓細胞微核率與輻射模型對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。另外，再由骨髓細胞DNA含量測定結果可知，各實驗組小鼠骨髓細胞DNA含量明顯高于輻射模型對照組，其中實驗組3的小鼠骨髓細胞DNA含量與輻射模型對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。說明羊肚菌液體發酵產物具有抗輻射損傷的功能，可降低機體染色體和造血系統受損程度。

3 結 論

本實驗按照衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)中的檢驗方法，對羊肚菌液體發酵產物進行增強免疫力功能和對輻射危害有輔助保護功能的實驗研究。通過對小鼠細胞免疫功能和單核-巨噬細胞功能實驗結果表明羊肚菌發酵產物具有增強免疫功能的作用；同時通過外周血白細胞計數實驗、骨髓細胞DNA含量實驗和小鼠骨髓細胞微核實驗結果表明羊肚菌發酵產物還具有對輻射危害有輔助保護功能的作用。該研究結果為將羊肚菌液體發酵產物開發成保健食品產品提供了科學依據。

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Functional Evaluation of Fermentation Products from Morchella

Lü Xiao-lian1，GUO Hong1，JIA Jian-hui1，TAO Guo-qin2，PENG Yi-jiao1，GUO Hong-yuan1，CAO Wei1，XU Zeng-hui1，TIAN Xu1
(1. Beijing Food Research Institute, Beijing 100162, China；2. Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China)

The immunoregulatory and anti-radiation effect of fermentation products (fermentation supernatant plus hot water extract of Morchella mycelia) from Morchella in mice was evaluated according to the Technical Standards for Testing & Assessment of Health Food (2003 version, Ministry of Health, People’s Republic of China) by mouse monocyte-macrophage function test, peripheral leukocyte count, DNA content of myeloma cells test and mouse bone marrow cell micronucleus test. Our results showed that these fermentation products can exert an immunoenhancing effect in mice and helped protect against radiation hazards and hence have great potential to be developed as immunoenhancing and anti-radiation products.

Morchella；fermentation；immunoenhancing effect；anti-radiation

TQ920.1；TS218

A

1002-6630(2013)01-0311-04

2012-11-23

呂曉蓮(1970ü)，女，高級工程師，碩士，研究方向為食品工程與營養。E-mail：xiaolian1992@sina.com