Twist1與Bcl-2協同促進肝癌細胞EMT 過程中的miRNA 表達譜變化

崔中水，孫保存，趙 楠，趙秀蘭，董學易，古 強

（1.天津醫科大學病理學教研室，天津300070；2.天津醫科大學附屬腫瘤醫院病理科，天津300060）

自1999年Maniotis等[1]發現血管生成擬態（vasculogenic mimicry，VM）這一新的腫瘤血供模式以來，國內外眾多學者致力于其具體發生機制的研究，上皮間充質轉變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）即是其中一種[2-4]。經典的EMT調控蛋白Snail和Slug是通過結合E-cadherin轉錄的E-box抑制其表達，但近年研究發現Twist1還可以通過其他未知途徑廣泛地抑制上皮樣表型并上調間充質表型，而且Bcl-2可以與Twist1協同作用，輔助Twist1入核，從而誘導EMT的發生，促進VM的形成[5-6]。miRNAs（microRNAs）是一類單鏈非編碼內源性小分子RNA，其轉錄獨立于其他基因，并不翻譯成蛋白質，而是在體內代謝過程中起調控作用。近年來國內外均有報道miRNA在腫瘤中異常表達，這些異常表達的miRNA可以通過激活原癌基因的表達和抑癌基因的突變缺失，從而引起腫瘤的發生發展[7]。因此，我們推測Bcl-2與Twist1協同作用激活多個下游靶基因mRNA的轉錄活性是否可能是通過miRNAs表達變化來實現的？本實驗通過分析對比Twist1、Bcl-2分別單獨過表達和共過表達時的miRNA譜，旨在找出與Twist1和Bcl-2協同作用相關的miRNAs。

1 材料與方法

1.1 細胞系和培養條件 肝細胞肝癌細胞系HepG2，購自美國典型培養物保藏中心（ATCC，美國）。

全部細胞按常規培養模式進行:培養基為Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）添加10%胎牛血清（FBS），均購自Invitrogen公司（美國）。培養條件為37℃，5%CO2：恒濕環境（Binder培養箱，德國）。按不同要求，細胞傳代擴增至60%～80%接觸匯合后收獲細胞。

1.2 表達質粒構建 Twist1基因CDS全長通過全基因合成（華大公司，深圳）獲得，亞克隆入pcDNA3后測序，與Genebank序列比對確定正確開放閱讀框用于后續實驗；表達上調質粒pcDNA3-Bcl2通過cDNA文庫亞克隆獲得，經過測序驗證。

1.3 質粒提取和細胞轉染 以DH5α超級感受態細菌擴增穿梭質粒，常規轉化大腸桿菌，氨芐青霉素抗性篩選單克隆，質粒大提，以TritonXll4抽提法去除內毒素。

細胞轉染采用新型轉染試劑：聚乙酞亞胺（percutanoous ethanol injection，pEI，polyseienee公司，Cat#23966）。細胞培養至70%～80%接觸匯合，轉染前一天更換為無血清培養液同步化細胞，轉染當日首先更換無血清、無抗生素新鮮培養液，以1∶4比例混勻質粒和轉染試劑，加入培養基，次日更換為條件培養液。24～48h后進行轉染效果評價或其他實驗。轉染效率和蛋白分析效果如高于50%可直接用于后續實驗。

1.4 miRNA芯片分析 采用空質粒、穩轉Twistl、穩轉 Bcl-2和穩轉 Twist1/Bcl-2分別獲得的HepG2-對照、HepG2-Twist1、HepG2-Bcl-2、HepG2-Twist1/Bcl-24組細胞作為樣品，利用miRNA芯片技術方法檢測不同處理對miRNA表達譜的影響。實驗由北京博奧公司完成。

1.5 統計學分析 全部數據輸入SPSS 13.5進行統計學分析，分別采用完全隨機設計t檢驗（Student’s t test）和多組比較單因素方差分析（ANOVA），以P<0.01作為檢驗水準。

2 結果

2.1 共過表達Twist1/Bcl-2組與對照組比較miRNA表達譜 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-對照組有11個miRNA表達高，有37個表達低（P< 0.01）（圖1）。其中有2個miRNA表達高10倍以上（表1），有1個表達低10倍以上（表2）。

表1 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-對照組表達高10倍以上的miRNATab 1 The miRNAs that expressed more than 10times higher in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2control group

表2 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-對照組表達低10倍以上的miRNATab 2 The miRNAs that expressed more than 10times lower in the HepG2-Twist1/Bcl-2groupthanintheHepG2controlgroup

2.2 共過表達Twist1/Bcl-2組與過表達Twist1組比較miRNA表達譜 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-Twist1組有13個miRNA表達高，42個表達低（P<0.01）（圖2）。其中有6個miRNA表達高10倍以上（表3），1個表達低10倍以上（P<0.01）（表4）。

表3 HepG2-Twistl/Bcl-2組比HepG2-Twistl組表達高10倍以上的miRNATab 3 The miRNAs that expressed more than 10times higher in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2-Twist1group

表4 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-Twist1組表達低10倍以上的miRNATab 4 The miRNAs that expressed more than 10times lower in the HepG2-Twist1/Bcl-2groupthanintheHepG2-Twist1group

2.3 共過表達Twist1/Bcl-2組與過表達Bcl-2組比較miRNA表達譜 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-Bcl-2組有17個miRNA表達高，24個表達低（P<0.01）（圖3）。其中有2個miRNA表達高10倍以上（表5），2個表達低10倍以上（表6）。

表5 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-Bcl-2組表達高10倍以上的miRNATab 5 The miRNAs that expressed more than 10times higher in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2-Bcl-2group

表6 HepG2-Twist1/Bcl-2組比HepG2-Bcl-2組表達低10倍以上的miRNATab 6 The miRNAs that expressed more than 10times lower in the HepG2-Twist1/Bcl-2group than in the HepG2-Bcl-2group

3 討論

miRNAs是由染色體DNA編碼，并在進化上高度保守，在細菌、病毒、真菌、植物和動物中都廣泛表達。其功能機制是在細胞核首先由RNA聚合酶Ⅱ轉錄成初始轉錄子（pri-miRNA），pri-miRNA經蛋白復合體處理后形成miRNA前體（pre-miRNA，約70nt），pre-miRNA在胞質被Dicer（核酸內切酶RNaseⅢ）剪切成雙鏈miRNA，雙鏈中的一條與含Argonautes的RNA沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）形成RISC-miRNA復合物后與靶基因mRNA的3′UTR（3′非翻譯區）完全或不完全的堿基互補結合，以實現其負性調節靶mRNA的功能，進而調節基因的表達。越來越多的研究發現，miRNA具有調節胚胎發育、細胞增殖、分化、凋亡等生物學功能[4]。miRNA與惡性腫瘤的發生、發展、預后有著密切的關聯。各種研究相繼報道了miRNA差異表達與惡性轉化標志（異常細胞生長、細胞死亡、分化、凋亡、侵襲和轉移）之間的分子功能聯系[4]。

本研究即是針對EMT相關蛋白Twist1與抗凋亡蛋白Bcl-2共表達時出現的miRNA表達譜變化來初步分析Twist1和Bcl-2相互作用引發廣泛生物學效應是否與某些miRNA相關。miRNA芯片結果表明：共過表達Twist1/Bcl-2可引起miRNA表達譜發生較明顯變化，且其發生變化的miRNA數量和范圍都不同于Twist1、Bcl-2單獨任何一者過表達時的表達變化情況。

本實驗組前期研究已經驗證了質粒的轉染效果是高效率的，而且表明Twist1能調控EMT表征蛋白E-cadherin表達下調、VE-cadherin表達上調進而促進EMT、VM，且共過表達Twist1/Bcl-2能使Twist1這一功能更強；通過比較4組細胞的功能發現共過表達Twist1/Bcl-2組的細胞增殖、遷移、侵襲和體內成瘤及在3D培養條件下形成管道等能力都比其他組明顯要強[3]。本文利用miRNA芯片技術分析了空白對照、單獨過表達Twist1、單獨過表達Bcl-2和共過表達Twist1/Bcl-24組細胞的miRNA表達譜，初步發現同時過表達Bcl-2和Twist1可使miRNA表達譜發生明顯變化，并且與單獨過表達Twist1或Bcl-2時發生的變化都不同，這表明Twist1和Bcl-2相互作用使更廣泛的miRNAs發生了變化或使變化更明顯，從而使得細胞功能產生非常廣泛的影響，甚至完全顛覆細胞表型。

本實驗結果顯示HepG2-Twist1/Bcl-2組與其他組相比差異倍數在10倍以上的miRNA有9個：hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-155、hsa-miR-1914、hsa-miR-424、hsa-miR-1246、hsa-miR-146a、hsamiR-200b、hsa-miR-4286、hsa-miR-193a-3p。在關于這9個miRNA在腫瘤生物學功能方面的研究中，miR-146b-5p通過靶向基質金屬蛋白酶MMP16抑制神經胰腺癌細胞的遷移和侵襲[8]；miR-155經常在一些癌癥中過表達，下調腫瘤抑制蛋白p53的表達，該蛋白與細胞凋亡相關[9]；hsamiR-1914尚未有研究發表；miR-424在腫瘤局部缺氧組織的血管重構及血管生成中發揮重要的促進作用[10]；has-miR-1246是細胞周期、凋亡和衰老相關基因p53家族的一個靶基因，并可通過抑制DYRK1A的表達激活NFAT，而NFAT的激活與腫瘤發生密切相關[11]；在前列腺癌的研究中發現，hsamiR-146a在去勢抵抗性前列腺癌中成低表達，并且過表達hsa-miR-146a可抑制體外腫瘤細胞生長、克隆形成和遷移以及體內成瘤性和血管形成等功能，其機制研究表明hsa-miR-146a可靶向抑制EGFR的表達，并可抑制MMP2的表達[12]；miR-200家族（miR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-141, and miR-429）是一類與EMT高度相關的miRNAs，而miR-200b被認為是腫瘤侵襲、轉移和化學敏感性等的關鍵調控子[13]；hsa-miR-4286在皮膚黑色素瘤中表達比良性黑色素痣明顯上調，但其發揮的具體作用目前尚未有發表[14]；hsa-miR-193a-3p在乳腺癌中作為腫瘤抑制因子通過與miR-124和miR-147共同靶向作用于EGFR進而抑制腫瘤細胞的細胞周期進程[15]。

在HepG2-Twist1/Bcl-2組發生變化的miRNA涉及異常細胞生長、細胞死亡、分化、凋亡、侵襲、轉移及血管生成等多種功能，因此我們推測Twist1和Bcl-2協同作用使上述9個關鍵的miRNA發生明顯的表達變化，導致miRNA對多個下游靶基因轉錄活性的調控作用發生改變，這些靶基因與細胞的信號轉導、增殖、血管生成、細胞骨架形成等多方面有關，結果不僅增強了腫瘤細胞的增殖、轉移、侵襲等惡性功能，而且誘導了EMT的發生及VM形成，最終促進腫瘤惡性及進展。但這些在HepG2-Twist1/Bcl-2組發生變化的miRNA在腫瘤發生發展過程中具體發揮什么功能，哪些是與Twist1和Bcl-2的相互作用直接相關的miRNA以及調控VM和EMT的機制還有待進一步研究。

綜上所述，本研究利用miRNA芯片技術發現共過表達Twist1/Bcl-2的HepG2肝癌細胞中miRNA發生明顯的差異表達，結合功能變化結果說明眾多miRNA發生表達變化可起到共同調控下游多個靶基因活性的作用，這一發現為進一步研究Twist1和Bcl-2相互作用引發腫瘤廣泛生物學效應的具體機制提供了有用的數據庫，而篩選出Twist1和Bcl-2可直接調控的miRNA并進行驗證以及對這些miRNA進行功能學的研究則是作者下一步即將開展的工作。

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