缺氧誘導神經干細胞凋亡作用機制研究

羅素慧，張緒梅，黃國偉

（天津醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生教研室，天津300070）

腦血栓、腦梗死、腦血管痙攣等缺血缺氧性腦損傷在臨床上常見，其發病率、致殘率和致死率均較高。尤其是發生于宮內和新生兒期的缺血缺氧性腦損傷，是造成腦癱、癲癇及智力低下的重要原因。近年來研究表明，神經細胞凋亡在腦缺血缺氧損害中發揮著重要作用，是缺血缺氧性腦損傷的重要機制之一[1]。有研究報道，低氧促進神經干細胞（NSCs）的存活增殖，長期缺氧則誘導NSCs的凋亡[2]。目前，缺血缺氧對NSCs凋亡影響的機制尚不清楚。本實驗將通過體外分離培養新生SD大鼠的海馬NSCs，探討缺氧對NSCs凋亡的影響及分子機制，為臨床預防和治療缺血性腦病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 24h內同窩新生SD大鼠，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養液、L-谷氨酰胺；F12和B27添加劑（美國Gibco公司）；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth facter,bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF,Perotech公司）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG/辣根酶標記，兔抗大鼠多克隆抗體Caspase-3(北京中杉金橋科技公司)；小鼠抗Bcl-2，小鼠抗Bax多克隆抗體（Cell signaling technology公司）；小鼠抗大鼠單克隆抗體βactin IgG、ECL發光試劑盒（Santa Cruz公司）；BCA蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物公司）；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技公司）；Rhodamine123(Sigma公司)。

1.1.3 儀器 3111型CO2水套培養箱（Thermoelectroncorporation，美國），VD-1320型超凈工作臺（哈爾濱市東聯電子技術公司），低溫高速離心機（Sigma），DYY-III8A穩壓穩流定時電泳儀（北京六一儀器廠），BD FACSCalibur流式細胞儀（美國Becton-Dickin－son公司），DYCZ-40D型迷你轉移槽（北京六一儀器廠），化學發光凝膠成像系統（美國MLTRA.LUM. Inc）。

1.2 方法

1.2.1 NSCs原代分離、培養 將新生SD大鼠用75%酒精浸泡15s，快速在超凈臺中取出腦組織，用手術鑷分離大腦半球，分離大腦皮層取出海馬，放入盛有HBSS緩沖液的無菌培養皿中，并用HBSS緩沖液洗2遍，DMEM/F12培養液洗一遍，剪碎成0.5mm×0.5mm小塊，用玻璃吸管反復吹打，細胞篩網（0.76μm）過濾，制成細胞懸液。將細胞懸液離心（800r/min）5min，去除上清液，加入培養液（DMEM/F12、EGF 20μg/L、bFGF 20μg/L、L-谷氨酰胺2mmol/L、2%B27、青霉素和鏈霉素100U/mL），細胞計數，以5×105/mL的密度接種于培養瓶。置37℃、5%CO2孵育箱中培養，隔天換液，倒置顯微鏡下觀察。

1.2.2 分組情況 將分離出的新生鼠NSCs分為2組：正常對照(NC)組、缺氧模型(Hyp)組。

1.2.3 缺氧模型建立 正常條件下（37℃、5%CO2）培養NSCs，于增殖第3天，將缺氧組細胞放入三氣培養箱進行缺氧培養，通過調整N2的濃度而設定所需O2的濃度（37℃，5%CO2、94%N2、1%O2），6h后取出放回CO2培養箱繼續培養，收集第6天細胞。

1.2.4 采用AnnexinV/PI雙標記流式細胞儀檢測NSCs凋亡率 收集缺氧后第6天的NSCs，采用機械吹打法吹打成單個細胞，分別置15mL離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，用4℃PBS重懸細胞并計數細胞密度，細胞數目達106～107/mL。取1mL細胞懸液，用4℃PBS洗滌兩次，重懸于500μL結合液(Binding Buffer)中，加入5μL FITC標記的AnnexinV，于25℃避光孵育30min，再加入5μL PI，室溫避光染色5min。在1h內進行流式細胞儀分析，同時以不加AnnexinV-FITC及PI的1管單細胞懸液作為陰性對照。激發波長480nm，計數104個細胞，數據經Cell Quest軟件分析處理，記錄位于右下象限的AnnexinV陽性、PI陰性細胞數的百分比，即細胞早期凋亡率。

1.2.5 流式細胞儀測定線粒體跨膜電位 收集缺氧后第6天的NSCs，采用機械吹打法吹打成單個細胞，分別置15mL離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，用4℃PBS重懸細胞并計數細胞密度，細胞數目達106～107/mL。取1mL細胞懸液，PBS洗滌，用新鮮培養基重懸細胞，加入Rhodamine1230.5μL (終濃度為0.5μmol/L)，于37℃避光孵育30min，再用PBS洗細胞3次，留細胞懸液1mL，過200目尼龍網。流式細胞儀FL1通道檢測聚集在細胞質中的綠色熒光單體。同時以不加Rhodamine123的1管單細胞懸液做為陰性對照，計數104個細胞，在流式細胞儀上用Cell Quest軟件分析，繪制線粒體膜電位變化的平均熒光值分布圖。其中橫坐標為線粒體膜電位的平均熒光值的對數值，縱坐標為細胞體積。

1.2.6 Western blot檢測缺氧NSCs凋亡相關蛋白Caspase-3和Bcl-2、Bax的表達 用Western-blot技術，將蛋白上清液與上樣緩沖液按5∶1的比例混合，100℃變性5min，冷卻后離心上樣。10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白，電轉至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，一抗1∶1000稀釋，4℃搖床孵育過夜，TBST（Tris-buffered saline Tween-20）漂洗5次，每次5min。二抗1∶10000稀釋。室溫搖床孵育2h，TBST漂洗3次，每次15min。化學發光，凝膠成像系統照相。

1.3 統計分析 采用SPSS 16.0軟件包處理數據，數據以±s的形式表示，均數間兩兩比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 缺氧對NSCs凋亡率的影響 缺氧處理后，收集第6天的NSCs，經流式細胞術檢測NSCs的凋亡率，圖1A、B分別為NC組和Hyp組的流式細胞術檢測結果（圖1）。對兩組結果進行統計學分析，缺氧處理組細胞早期凋亡率增加，且差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1C。

圖1 AnnexinV/PI雙標記流式細胞儀檢測NSCs凋亡率Fig 1 The apoptotic rate of NSCs detected by FCM

2.2 缺氧對NSCs線粒體跨膜電位的影響 圖2中A，B分別為線粒體跨膜電位結果。和正常對照組比較，缺氧處理組細胞熒光強度下降，線粒體跨膜電位降低，且差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2C。

圖2 流式細胞儀測定NSCs線粒體跨膜電位的變化Fig 2 The mitochondrial trans-membrane potential of NSCs

2.3 缺氧對NSCs凋亡相關蛋白Caspase-3活性表達的影響 用Western blot檢測Caspase-3表達。結果表明：缺氧處理后Hyp組Caspase-3活性表達高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

2.4 缺氧對NSCs線粒體通路凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 統計分析結果顯示：缺氧處理后Hyp組中抑凋亡蛋白Bcl-2的表達低于NC組，而促凋亡蛋白Bax的表達高于NC組，且差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖3 Western blot檢測Caspase-3表達Fig 3 The expression of Caspase-3detected by Western blot

圖4 Western blot檢測Bcl-2和Bax活性表達Fig 4 The expression of Bcl-2and Bax detected by Western blot

3 討論

NSCs在神經發育和修復受損神經中發揮重要作用，是當前神經科學領域的研究熱點，其凋亡是一個非常復雜的過程，受到內外環境中眾多調節因子的調節，組成復雜的調控網絡，但其確切調控機制尚不明確。氧作為機體重要的病理生理調節因素，其濃度的改變可以影響生命過程，輕度缺氧可通過機體自身代償性的生理性調節，減輕對機體的損傷，如果氧濃度的改變超出了機體正常生理代償的范圍，可以引發多種疾病和衰老退變[3]。腦組織間隙中氧水平較低，其范圍在0.55%～8%，研究發現，在5%的氧濃度下，神經干細胞表現增殖增加，而在<1%的氧濃度下則會誘發神經細胞的凋亡[4]，但凋亡具體調控機制尚不明確。本實驗結果顯示，將原代培養的NSCs在第3天進行1%O2缺氧處理，6h后恢復正常培養，6d后檢測細胞的凋亡率，發現細胞凋亡率升高，且差異有統計學意義，表明缺氧可能誘導NSCs的凋亡，進而影響到因缺血缺氧造成神經損傷的修復。

凋亡是指細胞在一定生理或病理條件下，由基因控制，通過表達特定的RNA和蛋白質介導的細胞自主而有序地死亡，在正常腦發育過程中起著非常重要的作用。細胞凋亡是受高度調控的程序性死亡過程，在眾多的信號傳導通路中，B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）蛋白家族在細胞凋亡的線粒體途徑中起重要調控作用[5]。Bcl-2家族包括兩類蛋白質：一類是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等；另一類是促凋亡蛋白，包括Bax、Bid、Bak等，其中Bcl-2和Bax是目前研究相對比較明確的功能對立的細胞凋亡調控蛋白。Bax是重要的促凋亡蛋白，一種可溶性的蛋白分子，正常情況下Bax蛋白位于細胞質中，但當凋亡發生時，通過增加線粒體膜通透性使其從胞漿轉移到線粒體并與線粒體膜相結合[6]，形成同源二聚體后被激活，發生構象改變，可引起線粒體大量釋放CytC，啟動Caspase-3的活化，誘導細胞凋亡；另外，Bax的促凋亡作用能被Bcl-2所抑制。國內外研究資料表明，大鼠海馬區神經元對腦缺血缺氧反應敏感，缺血早期即以凋亡、壞死為主，最終導致神經元數目減少，超微結構發生變化，進而影響動物的學習、記憶功能[7-8]。但是，目前缺氧對神經干細胞凋亡的作用機制尚不明確。我們實驗發現，缺氧處理后，線粒體通路中抑凋亡蛋白Bcl-2活性表達下降，促凋亡蛋白Bax活性表達升高，從而激活凋亡蛋白Caspase-3表達，故推測缺氧可改變多種凋亡相關蛋白的表達，打破了其動態平衡，從而產生細胞毒性作用，導致神經干細胞的凋亡。

總之，缺氧損傷可激活凋亡蛋白的表達，誘導NSCs凋亡，在缺血性腦病的預防、治療有一定臨床意義。本實驗結果為缺血缺氧性胚胎腦損傷的基礎和臨床研究提供了一定的實驗依據，但缺氧對NSCs的更多機制仍有待進一步研究。

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