能同時降解嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素的芽孢桿菌篩選

徐海軍，李 慧，張德華，夏倫斌，余道倫，高俊梅

（1.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012；2.安徽九鼎農(nóng)業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，安徽 六安 237000）

霉菌毒素是由真菌產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)。土壤、植物和青貯飼料中均可發(fā)現(xiàn)霉菌毒素。霉菌毒素既可在農(nóng)作物大田收獲時形成，在不適宜的貯存條件下，也可繼續(xù)在收獲后的農(nóng)作物上形成。較高的濕度通常有利于飼料中霉菌的生長和霉菌毒素的產(chǎn)生。飼料中檢出率比較高和對動物影響比較大的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素。

黃曲霉毒素主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代謝產(chǎn)物，其化學結(jié)構(gòu)類似，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。一般來說，溫度30 ℃、相對濕度80%、谷物水分在14%以上（花生的水分在9%以上）最適合黃曲霉菌繁殖和生長。在24～34 ℃，黃曲霉菌產(chǎn)毒量最高。

嘔吐毒素又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，主要是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀桿菌產(chǎn)生的化學結(jié)構(gòu)和生物活性相似的有毒代謝產(chǎn)物（單端孢霉烯族化合物中的一種）構(gòu)成，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品。人和動物在誤食被該毒素污染的糧谷類后可以產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。

玉米赤霉烯酮又稱F2毒素，是由禾谷鐮刀菌等菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，是一種雌激素真菌毒素。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、麥類、谷物等，在世界各地各種糧谷與飼料中均有存在。玉米赤霉烯酮具有較強的生殖毒性和致畸作用，可引起動物發(fā)生雌激素亢進癥，導(dǎo)致動物不孕或流產(chǎn)，對家禽、豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失。

霉菌毒素的生物降解是近年來國內(nèi)外霉菌毒素脫毒技術(shù)方面的一個研究熱點。徐劍宏等[1]用脫氧雪腐鐮刀菌烯醇多次傳代富集培養(yǎng)從小麥的土壤中分離到一株霉菌毒素降解菌，該菌對不同單端孢霉烯族毒素的降解率達到90%以上。牛天貴等[2]用香豆素為唯一碳源的培養(yǎng)基，以動物糞便、發(fā)霉糧食、腐敗飼料、枯枝敗葉和發(fā)酵食品為實驗材料，先進行初篩，獲得能降解香豆素的菌株，再分別以黃曲霉毒素B1或赭曲霉毒素A為唯一碳源的培養(yǎng)基進行第2次篩選，結(jié)果獲得一株對黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A均能降解的地衣芽孢桿菌。進一步試驗表明，此地衣芽孢桿菌對玉米面中低濃度和高濃度的黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A均能有效降解，降解率分別達到82.9%、78.3%和75.0%、73.5%。陳志敏等[3]分別將黃曲霉毒素降解菌、玉米赤霉烯酮降解菌和嘔吐毒素降解菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，然后通過固液分離、超濾濃縮獲得3種細菌的霉菌毒素降解酶液，復(fù)合配制成霉菌毒素降解酶制劑，對飼料霉菌毒素的去除率達到80%以上。這些研究表明應(yīng)用酶解技術(shù)降解飼料中的霉菌毒素具有很好的應(yīng)用前景。

產(chǎn)酶益生素可以提高畜禽對日糧的消化利用率，減少糞便排放量，提高畜禽的生產(chǎn)性能。芽孢桿菌以芽孢形式存在時，對環(huán)境的抵抗力強，在適宜條件下又可復(fù)活，恢復(fù)生物學功能。因此，芽孢桿菌是生產(chǎn)益生素的良好菌種。本研究旨在篩選對黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮均有較好降解作用的芽孢桿菌，以便為開發(fā)具有霉菌毒素降解作用的新型產(chǎn)酶益生素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 豬糞

安徽九鼎農(nóng)業(yè)科技發(fā)展股份有限公司原種場中的健康成年母豬正常糞便。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g、牛肉膏0.3 g、瓊脂1.5 g、蒸餾水100 mL，pH7.2～7.4。

富集培養(yǎng)基(牛天貴，2009)：(NH4)2HPO40.1 g、KH2PO40.1 g、Na2HPO40.2 g、Na2SO40.05 g、NaNO30.1 g、3種霉菌毒素(黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮)適量(第1、2和3次富集濃度分別為1、5、10 mg/L)、 蒸 餾 水100 mL，pH7.2～7.4。

霉菌毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基(牛天貴，2009)：蛋白胨0.5 g、牛肉膏0.3 g、霉菌毒素 0.5 mg、蒸餾水 100 mL、pH 7.2～7.4。

1.1.3 主要試劑

玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和黃曲霉毒素標準品購自天津一方科技有限公司。玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和黃曲霉毒素的ELISA檢測試劑盒購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器

手提式高壓滅菌鍋（上海銳風儀器制造有限公司）、SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作操作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、TGL-16臺式高速離心機（金壇市岸頭良友實驗儀器廠）、GHX-9080B型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海比朗儀器有限公司）、GKC214數(shù)顯控溫水浴鍋（上海蘇進儀器設(shè)備廠）、生物顯微鏡（上海滬粵明科學儀器有限公司）、318MC型酶標儀（上海三科儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 霉菌毒素降解菌的富集培養(yǎng)

稱取0.5 g母豬糞便放入滅菌試管中，加入5 mL滅菌生理鹽水，用滅菌吸管充分吸吹混勻。用無菌紗布封好試管口后，放入80 ℃水浴中加熱15 min殺死非芽孢菌，取出冷卻后，用無菌生理鹽水按100倍、1 000倍、10 000倍梯度稀釋樣品。分別取各稀釋度的樣品溶液100 μL涂布接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)7 d，直到菌落充分長出。

將各平板上長出的菌落用滅菌生理鹽水洗下，混合后作為原始菌液，約8 mL。將原始菌液放入80 ℃水浴中加熱15 min以充分殺死非芽孢菌，冷卻后吸取100 μL涂布接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。將長出的菌落用5 mL滅菌生理鹽水洗下，吸取100 μL菌液接種到5 mL第1次富集培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1周。取100 μL第1次富集培養(yǎng)菌液，傳代接種于5 mL第2次富集培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1周，再取100 μL所得培養(yǎng)物，傳代接種于5 mL第3次富集培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1周。這樣共傳代富集3次。

1.2.2 霉菌毒素降解菌的定向篩選

1.2.2.1 能降解嘔吐毒素的芽孢桿菌定向篩選 將最終富集培養(yǎng)獲得的菌液10 000 r/min離心15 min，棄上清液，向沉淀中加入無菌生理鹽水5 mL，10 000 r/min離心15 min，棄上清液，同法清洗3次以除去富集培養(yǎng)菌液中殘留的富集培養(yǎng)基液。最后一次離心獲得的細菌沉淀，用5 mL滅菌生理鹽水懸浮。取100 μL菌液接種于5 mL嘔吐毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)蘸取菌液劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取營養(yǎng)瓊脂平板上長出的單菌落分別接種于5 mL嘔吐毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。分別將各單菌落的培養(yǎng)液在10 000 r/min離心15 min，吸取各自上清2 mL，用嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒測定嘔吐毒素含量（T1），測定方法參照試劑盒說明書。以嘔吐毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基的嘔吐毒素含量（T0）為參照，計算各單菌落對嘔吐毒素的降解率：x(%)=（T0-T1）/T0×100%。

1.2.2.2 能降解玉米赤霉烯酮的芽孢桿菌定向篩選 將對嘔吐毒素降解率達70%以上的嘔吐毒素降解菌分別轉(zhuǎn)接到玉米赤霉烯酮定向篩選培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h。參照嘔吐毒素降解率的測定方法，用玉米赤霉烯酮ELISA檢測試劑盒檢測玉米赤霉烯酮含量，并計算培養(yǎng)后玉米赤霉烯酮的降解率。

1.2.2.3 能降解黃曲霉毒素B1的芽孢桿菌定向篩選 將對玉米赤霉烯酮降解率達70%以上的玉米赤霉烯酮降解菌分別轉(zhuǎn)接到黃曲霉毒素B1定向篩選培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。參照嘔吐毒素降解率的測定方法，用黃曲霉毒素B1 ELISA檢測試劑盒檢測培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中黃曲霉毒素B1含量，并計算培養(yǎng)后黃曲霉毒素B1的降解率。

1.2.3 目標細菌的形態(tài)觀察

選取對嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1綜合降解率最理想的菌種作為目標菌種。將目標菌種劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察記錄菌落形態(tài)。挑取單菌落，制成涂片，分別進行革蘭氏染色和美蘭染色，觀察其菌落形態(tài)。

2 結(jié)果和分析

2.1 霉菌毒素降解菌的富集培養(yǎng)結(jié)果

圖1 不同深度豬糞溶液涂布接種于營養(yǎng)瓊脂平板上的細菌生長結(jié)果

本實驗的目標是獲得能同時降解主要霉菌毒素的芽孢桿菌。為了減少非芽孢菌的影響，本實驗將豬糞稀釋液加熱后用于培養(yǎng)。盡管如此，豬糞溶液在不高于1:1 000稀釋時，涂布接種于營養(yǎng)瓊脂平板上后，仍可長出大量菌落（見圖1）。說明豬糞中的芽孢桿菌數(shù)量非常多，這在理論上為篩選出對嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1能同時降解的芽孢桿菌提供了可能性。為了進一步減少非芽孢菌對后續(xù)實驗的影響，本實驗對豬糞初次分離菌再一次加熱后才用于富集培養(yǎng)。

表1 嘔吐毒素降解菌定向篩選結(jié)果 %

表2 玉米赤霉烯酮降解菌定向篩選結(jié)果 %

表3 黃曲霉毒素B1降解菌定向篩選結(jié)果 %

本實驗的富集培養(yǎng)進行了3次，每次培養(yǎng)時間為1周。采用較長的培養(yǎng)時間和反復(fù)富集培養(yǎng)有利于提高最終菌液中霉菌毒素降解菌的比例。

2.2 霉菌毒素降解菌定向篩選的結(jié)果

本實驗先用嘔吐毒素進行定向篩選，結(jié)果獲得10株對嘔吐毒素降解率達70%以上的菌株，分別命名為ODS-1、ODS-2、ODS-3、ODS-4、ODS-5、ODS-6、ODS-7、ODS-8、ODS-9和ODS-10（見表1）。再用玉米赤霉烯酮對這10株細菌進行定向篩選，結(jié)果ODS-1、ODS-2、ODS-5和ODS-8對玉米赤霉烯酮的降解率也達到70%以上（見表2）。最后用黃曲霉毒素B1對ODS-1、ODS-2、ODS-5和ODS-8進行定向篩選，結(jié)果只有ODS-1對黃曲霉毒素B1的降解率達70%以上（見表3）。因此，本實驗中篩選到的ODS-1對這3種霉菌毒素均有較好的降解率，是本研究的目標細菌。

2.3 目標細菌的形態(tài)觀察

ODS-1菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上生長迅速，培養(yǎng)時間較短時即可長成灰白色、半透明、圓形、表面光滑的菌落，培養(yǎng)時間較長時菌落表面可皺縮（見圖2）。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果表明ODS-1菌株為革蘭氏陰性桿菌（見圖3）。

3 討論

圖2 ODS-1在營養(yǎng)瓊脂平板上生長時的菌落形態(tài)

圖3 ODS-1細菌形態(tài)。A:革蘭氏染色；B:美蘭染色。

霉菌毒素對畜牧業(yè)和人類健康都有極大的危害。飼料中霉菌毒素的污染是一個普遍現(xiàn)象。雖然物理吸附是當前控制飼料霉菌毒素污染的主要途徑，但物理吸附劑常常只對某一種霉菌毒素有較強選擇性，對其他種類的霉菌毒素選擇性不強，并且物理吸附劑還易導(dǎo)致對營養(yǎng)素的吸附，從而可能影響營養(yǎng)素的吸收。霉菌毒素的生物降解技術(shù)具有安全性高、特異性強的優(yōu)點而被人們寄于厚望。以往的研究大多僅側(cè)重于篩選對某一種霉菌毒素有降解作用的細菌。由于飼料中污染的霉菌毒素種類繁多，特別是黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮是最常見的霉菌毒素。所以，篩選能對這3種霉菌毒素都具有較好降解作用的細菌非常重要，有利于降低生產(chǎn)成本。許多研究表明，一些細菌對霉菌毒素的降解具有多能性，即能同時降解不同結(jié)構(gòu)類型的霉菌毒素。例如，牛天貴等(2008)[2]就篩選獲得一株對黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素都具有較好降解作用的芽孢桿菌。徐劍宏等(2008)[3]則篩選到一株不產(chǎn)芽孢的德沃氏菌，該菌對飼料中嘔吐毒素、黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率分別達到95.3%、92.4%和75.6%。本研究中篩選到的ODS-1菌株對嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1的降解率也分別達到96.2%、94.6%和78.9%，這為將其開發(fā)成霉菌毒素降解菌劑奠定了基礎(chǔ)。

和非芽孢菌相比，芽孢桿菌具有優(yōu)良的抗逆性，能耐受飼料制料和貯存過程中的不利生存條件。因此，芽孢桿菌更有利于在實際生產(chǎn)中應(yīng)用。同時，芽孢桿菌也常常是優(yōu)良的益生菌，在畜禽的腸道中可以分泌消化酶，拮抗病原菌的生長。本研究從母豬糞便中篩選到一株對飼料中污染的主要霉菌毒素（嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1）均有較好降解作用的芽孢桿菌，為開發(fā)具有霉菌毒素降解功能的新型產(chǎn)酶益生素提供了新思路。對于ODS-1菌株的確切鑒定還需進一步研究。

[1] 陳志敏,丁宏標,喬宇,等.一種生物降解飼料中霉菌毒素的復(fù)合酶：中國，200910241454.7[P].2009-12-09.

[2] 牛天貴,梁志宏,計成，等.一株能同時降解黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A的菌株的篩選、培養(yǎng)和應(yīng)用：中國，200810224726.8[P].2008-12-10.

[3] 徐劍宏，史建榮，陸瓊嫻，等.一種能對霉菌毒素降解的菌株及其制劑的制備方法：中國，200810122672.4[P].2010-06-09.