南瓜中甘油糖脂分離制備及體外抗腫瘤活性研究

蔣志國 王燕華 鐘秋平 張海德

（海南大學食品學院1，海口 570228）

（海南大學信息學院2，海口 570228）

南瓜屬作物（Cucurbita）為葫蘆科南瓜屬的世界性蔬菜，在中國栽培十分普遍。隨著人民飲食結構的改善和對南瓜營養成分保健價值深入的研究，南瓜越來越受到重視，其栽培面積、單產及總產量迅速增長。近幾年南瓜產業在海南發展迅速，2008年種植面積為12萬畝，2009年為15萬畝，2010年達20萬畝，位居海南省蔬菜栽培面積的第4位，已成為海南冬季北運瓜菜的主要種類之一［1］。充分利用海南省豐富的南瓜資源，提高農產品附加值，不斷挖掘其新的利用價值和應用領域，具有重要的現實意義。

南瓜的諸多營養保健功能早已為人們所熟知，如降血糖血壓、調血脂，防治動脈硬化等［2－3］。迄今為止，有關南瓜中活性成分的分離提取，研究者主要關注的是南瓜中的多糖，但對其中小分子甘油糖脂的分離提取、結構鑒定以及活性研究還未見報道。作為細胞膜的重要組成部分，甘油糖脂具有抗氧化［4－5］、抗病毒［6］、抗炎［7－9］、抗腫瘤［10－13］等多種生物活性。甘油糖脂有效成分的制備分離是進一步研究分子結構、生物活性及構效關系的基礎，盡管目前己有多種有效成分的提取分離方法，如高效薄層層析法、柱層析法等，但都不同程度地存在著提取時間長、提取過程繁瑣、分離純化困難等不足［14］。

本研究擬采用高速逆流色譜分離技術與制備型高效液相相結合的方法，以南瓜（Cucurbita moschata）為原料，探索出一套完整的天然產物中有效成分甘油糖脂的提取、分離、純化的工藝。進而研究其抗腫瘤活性，闡明其構效關系，以期為進一步開發利用南瓜資源提供試驗依據，提高農產品附加值。

1 材料與方法

1.1 材料

南瓜（Cucurbita moschata）：海南儋州。小鼠黑色素瘤B16－F10細胞和人結腸癌COLO205細胞：中科院上海細胞庫。

DMEM培養基和胰蛋白酶（trypsin）：Gibco公司；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑藍（3－［4，5－Dimethylthiazol－2－yl］－2，5－diphenylte trazolium bromide，MTT）：美國 Sigma公司；D4020型大孔吸附樹脂：天津南開大學化工廠；乙腈（色譜純）：德國Merk公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

HSCCC－D1200高速逆流色譜儀：浙江工商大學食品與生物工程研究所；K－1800恒流泵：德國Knauer公司；BSZ－100自動部分收集器：上海滬西分析儀器廠；Model 8823A－UV紫外檢測器：北京新技術應用研究所。聚四氟乙烯螺旋管纏繞在5個水平軸上形成螺旋管（5 mm I.D.柱容積1 200 mL），轉速0～1 000 r／min；ZQ2000質譜檢測器：美國 Waters公司；Unity INOVA300，500高分辨核磁共振波譜儀：美國Varian公司；LC－20A分析型HPLC：日本Shimadzu公司；LC－29103制備型 HPLC：日本 JAI公司；ROTARY VACUUM EVAPORATOR N－1000旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司；GF254鋁膜 TLC板：德國Merck公司。Shellab Model 2300型CO2培養箱：Sheldon Manufacturing公司；DG3022A型酶聯免疫檢測儀：華東電子管廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預處理

將冷凍干燥南瓜果肉粉15 kg用95%甲醇常溫浸提3次，每次甲醇用量50 L，并不斷攪拌。合并浸提液，減壓濃縮至無醇味后，將浸膏物分散于5 L蒸餾水中，依次用等體積氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次，萃取液減壓濃縮后分別得到氯仿浸提物350 g、乙酸乙酯浸提物80 g和正丁醇浸提物100 g。

1.3.2 大孔吸附樹脂柱色譜分離

南瓜氯仿浸提物350 g上樣后，依次用蒸餾水、30%甲醇、60%甲醇、和90%甲醇洗脫，每次3個柱體積，洗脫液旋轉蒸發、冷凍干燥后得60%甲醇洗脫部分（Fr60）6.4 g，待用。

1.3.3 HSCCC溶劑系統的選擇

將樣品溶解于不同溶劑系統中，劇烈振蕩后靜置分層，測定其分層時間。用毛細管取近似等量的上下兩相溶液于TLC板上。通過觀察斑點色度，比較分配系數的差異，選擇合適的溶劑系統。展開劑為氯仿－甲醇 －水（65∶35∶10，體積比，下層），顯色劑為10%硫酸甲醇溶液。

1.3.4 溶劑系統的準備

本試驗所用溶劑系統為氯仿－石油醚－甲醇－水（5∶2∶6∶4，體積比），將 4種溶劑按比例配置于分液漏斗中，充分振蕩后靜置分層。

1.3.5 HSCCC分離過程

在60 mL流動相中加入3 g樣品，充分振蕩，使樣品完全溶解，注入三通進樣閥。將固定相以一定的流速充滿色譜柱，然后將柱的首段與三通進樣閥相接。開啟速度控制器，當轉速達到800 r／min時，以2 mL／min的流速泵入流動相，并通過三通進樣閥進樣。當流動相從色譜柱流出時用部分收集器收集，并采用TLC點樣檢測分離情況。

1.3.6 分析型高效液相－蒸發光散射（HPLCELSD）分析

色譜柱：Waters Symmetry Cl8（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水（60∶40）；流速：1.0 mL／min；柱溫：25℃；SEDEX75蒸發光檢測器參數：載氣為空氣，漂移管溫度70℃，ELSD的增益值為7，壓力0.35 MPa。

1.3.7 制備型高效液相（Pre－HPLC）分析

制備柱：ODS－BP－30（250 mm×30 mm，15μm）；流動相：乙腈：水（55：45）；流速：10.0 mL／min；柱溫：25℃；進樣量：3.0 mL；樣品濃度：300 mg／mL。

1.3.8 體外腫瘤細胞增殖抑制試驗［15］

采用MTT法檢測藥物對細胞的抑制作用。取人結腸癌COLO205細胞和小鼠黑色素瘤B16－F10對數生長期腫瘤細胞，調整細胞懸液濃度，每孔100μL細胞懸液接種于96孔細胞培養板中，接種24 h后給藥（100μL／孔），分別設空白對照組和不同濃度藥物組（62，125，250，500μg／mL），每組設3個復孔。繼續培養72 h后每孔加入 100μL MTT（1 mg／mL，以DMEM培養液溶解），37℃培養2 h，棄去各孔內液體后加入150μL酸化異丙醇（含 0.04 mol／L HCl），避光放置30 min，DG3022A型酶聯免疫檢測儀測定570 nm處吸光度，計算抑制率。

1.4 數據處理

用SPSS17.0軟件將抑制率數據和甘油糖脂處理濃度進行logistic曲線擬合并進行probit轉化，計算IC50。

2 結果與討論

2.1 HSCCC分離溶劑體系選擇

為了檢查溶劑系統的適用性，需要對分配系數進行測定。本試驗采用薄層色譜法（TLC）進行溶劑系統的選擇，即根據斑點色度估計樣品組分在兩相溶劑中的分配情況。雖然TLC法的準確度較低，但方便、快速。按照溶劑系統選擇的原則和大量的篩選，得到以下3種溶劑系統。

圖1 糖脂在3種溶劑系統中上下相的薄層色譜圖

由圖1可知，甘油糖脂粗提取物（Fr60）中至少有3種甘油糖脂單體 GCL－I、GCL－II和 GCL－III，即Rf＝0.19，Rf＝0.33，Rf＝0.55。由于不同的甘油糖脂單體所含糖基個數不同，極性差異較大，因此在溶劑系統 A中，GCL－I和 GCL－II主要集中在下相，而GCL－III主要集中在上相，分配系數很不理想。為了使甘油糖脂組分GCLI和GCL－II在溶劑系統上相中有合適的分配，需在溶劑體系A的基礎上加入一定量的石油醚溶劑，由于石油醚主要進入下相，使得下相極性變弱，迫使一部分甘油糖脂組分向上相轉移，從而得到合適的分配系數。最后，選定系統C作為高速逆流色譜分離的溶劑體系，即氯仿－石油醚－甲醇 －水（5∶2∶6∶4）。

2.2 HSCCC洗脫模式的選擇

由于HSCCC允許粗樣直接上樣分離，有時樣品非常復雜，其組分所覆蓋的極性范圍很寬（如甘油糖脂組分 GCL－I、GCL－II和 GCL－III），采用梯度或等比例洗脫很難實現一次性分離，因此本試驗采用雙向洗脫模式（dual－mode elution），即第一步采取反向洗脫（上相為固定相，下相為流動相），第二步采取正向洗脫（上相為流動相，下相為固動相）［16］。

2.3 溶劑系統C HSCCC－D1200分離結果

第一步采取反相洗脫，以上相為固定相，下相為流動相。試驗條件：氯仿－石油醚－甲醇－水（5∶2∶6∶4），進樣量 3.0 g，流動相流速為 2.0 mL／min，轉速800 r／min，收集 6 min／tube（15 mL試管），固定相保留率62%。根據TLC結果（圖2）可知，通過第一步反向洗脫后，可將甘油糖脂組分GCL－I和GCL－II完全分離開來。合并30～72管和84－134管，旋轉蒸發和冷凍干燥后分別得GCL－I（300 mg）和GCL－II（600 mg）。

圖2 HSCCC－D1200分離南瓜甘油糖脂的薄層色譜圖

第二步采取正向洗脫，即當GCL－I和GCL－II被分離后，將原來的固定相換作流動相，從相反的方向泵入柱中。根據TLC結果（圖3）可知，通過第二步正向洗脫后，可將甘油糖脂組分GCL－III分離開來。合并10～56管，旋轉蒸發和冷凍干燥后得GCL－III（300 mg）。

圖3 HSCCC－D1200分離南瓜甘油糖脂的薄層色譜圖

2.4 HPLC制備分離

經高效液相－蒸發光散射（HPLC－ELSD）檢測發現，3種甘油糖脂組分 GCL－I、GCL－II和GCL－III并不是單體，它們都分別含有2種化合物，說明這2種化合物結構極其相似，采用HSCCC很難一步將其分離，還需進一步聯合制備型HPLC分離。

圖4為組分 GCL－I、GCL－II、GCL－III的制備型HPLC分離圖譜。收集主峰，減壓濃縮至干，最后冷凍干燥，分別得到化合物 1（105 mg）、2（145 mg）、3（250 mg）、4（245 mg）、5（105 mg）和6（120 mg），經HPLC－ELSD測定，純度均達到98%以上。

圖4 GCL－I，GCL－II和GCL－III的制備型HPLC色譜圖

2.5 結構鑒定

應用多種波譜學方法（1H NMR，13C NMR，DEPT 90／135，HSQC，HMBC，HR－ESI－MS等），參照文獻［17］，確定6個單體化合物分別為二半乳糖亞麻酰甘油（DGMG，18∶3）、二半乳糖亞油酰甘油（DGMG，18∶2）、三半乳糖亞麻酰甘油（TGMG，18∶3）、三半乳糖亞油酰甘油（TGMG，18∶2），四半乳糖亞麻酰甘油（QGMG，18∶3）和 四半乳糖亞油酰甘油（QGMG，18∶2），如圖5。

圖5 甘油糖脂的結構式

2.6 甘油糖脂的抗腫瘤活性

表1 甘油糖脂對人結腸癌細胞COLO205和小鼠黑色素瘤細胞B16－F10體外增殖抑制效果（IC50）

由表1可以看出，6種甘油糖脂對人結腸癌細胞COLO205和小鼠黑色素瘤細胞B16－F103均有一定的生長抑制作用。構效關系表明，雙糖三鍵甘油糖脂DGMG（18∶3）對人結腸癌 COLO205細胞和小鼠黑色素瘤B16－F10細胞的抗腫瘤活性最強（P＜0.01），其半數抑制濃度 IC50分別為0.052 mg／mL和0.046 mg／mL，TGMG（18∶3）次之，而四糖雙鍵甘油糖脂QGMG（18∶2）抗腫瘤活性最弱，說明甘油糖脂結構組成對其活性有很大的影響，即脂酰基飽和度的不同、糖基數目的不同都會影響到甘油糖脂的抗腫瘤活性。表1數據顯示，甘油糖脂抗腫瘤活性隨著分子中半乳糖基數目的增多，活性減弱，雙糖活性最強，四糖活性較弱；分子中糖基數目一定，抗腫瘤活性隨著不飽和程度的增加而提高，如含3個不飽和鍵的甘油糖脂 DGMG（18∶3）和 TGMG（18∶3）抗腫瘤活性分別強于含2個不飽和鍵的甘油糖脂DGMG（18∶2）和TGMG（18∶2），這一研究結果與Hou CC等的研究結果相一致。Hou CC等［12］從昭和草中分離得到一種含雙亞麻酰基的甘油糖脂dLGG，結構－活性相關性研究證明雙亞麻酰基甘油結構部分為重要的活性結構特征，富含dLGG成分的昭和草萃取物較癌癥化療藥劑——順鉑更顯著抑制小鼠皮膚黑色素腫瘤的生長。

3 結論

本研究采用高速逆流色譜與制備型高效液相相結合的方法，從南瓜中制備出6種高純度的甘油糖脂單體，該方法制備量大（達到克量級），分離效率高，節約成本（溶劑系統可反復使用），是一種極具潛力的制備方法。抗腫瘤作用的試驗研究表明，6種甘油糖脂單體對人結腸癌細胞COLO205和小鼠黑色素瘤細胞B16－F103均有一定的生長抑制作用，其中雙糖三鍵甘油糖脂 DGMG（18∶3）對人結腸癌 COLO205細胞和小鼠黑色素瘤B16－F10細胞的抗腫瘤活性最強，其半數抑制濃度IC50分別為0.052 mg／mL和0.046 mg／mL，TGMG（18∶3）次之，而四糖雙鍵甘油糖脂QGMG（18∶2）抗腫瘤活性最弱。構效關系表明，抗腫瘤能力隨著脂酰基不飽和程度的增加而提高，隨糖基數目的增加而降低。南瓜中糖苷類化合物作為抗腫瘤藥物具有較好的開發前景。需要說明的是，盡管提取過程中使用了大量的對人體有害物質，但將提取物中的有毒的有機溶劑蒸干后，再加入無毒的有機溶劑，比如乙醇，再將乙醇蒸干后，基本上就檢不出有毒的有機溶劑殘留了，因而不會影響該化合物在食品工業中的應用。

［1］云天海，陳貽誦，鄧長智，等.熱帶地區農家品種南瓜露地節水設施栽培技術［J］.北方園藝，2010（24）：78－79

［2］劉穎，金宏，許志勤.南瓜多糖對糖尿病大鼠血糖和血脂的影響［J］.中國應用生理學雜志，2006，22（3）：83－84

［3］柳紅，張靜.不同南瓜多糖體外清除羥基自由基作用的研究［J］.武漢植物學研究，2007，25（4）：356－359

［4］Matsufuji M，Nagamatsu Y，Yoshimoto A.Potective effects of bacterial glyceroglycolipid M874B against cell death caused by exposure to heat and hydrogen peroxide［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2000，89（4）：345－349

［5］Nakata K.High resistance to oxygen radicals and heat is caused by a galactoglycerolipid in Microbacterium sp.M874［J］.The Journal of Biochemistry，2000，127（5）：731－737

［6］Nakata K，Guo C T，Matsufuji M，et al.Influenza a virusbinding activity of glycoglycerolipids of aquatic bacteria［J］.Journal of Biochemistry（Tokyo），2000，127（2）：191－198

［7］Berge JP，Debiton E，Dumay J，et al.In vitro anti－inflammatory and anti－proliferative activity of sulfolipids from the red alga Porphyridium cruentum［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50：6227－6232

［8］Larsen E，Kharazmi A，Christensen L P，et al.An antiinflammatory galactolipid from rose hip（Rosa canina）that inhibits chemotaxis of human peripheral blood neutrophils in vitro［J］.Journal of Natural Products，2003，66（7）：994－995

［9］Bruno A，Rossi C，Marcolongo G，et al.Selective in vivo anti－inflammatory action of the galactolipid monogalactosyldiacylglycerol［J］.European Journal of Pharmacology，2005，524：159－168

［10］Maeda N，Hada T，Murakami－Nakai C，et al.Effects of DNA polymerase inhibitory and antitumor activities of lipase－hydrolyzed glycolipid fractions from spinach［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2005，16（2）：121－128

［11］Perez Gutierrez R M，Lule P R.Cytotoxic constituents from daphnia pulex［J］.Pharmaceutical Biology，2005，43（4）：313－316

［12］Hou CC，Chen Y P，Wu J H，et al.A galactolipid possesses novel cancer chemopreventive effects by suppressing inflammatory mediators and mouse B16 melanoma［J］.Cancer Research，2007，67（14）：6907－6915

［13］王輝，李藥蘭，沈偉哉，等.硫酸甘油糖脂體外抑制腫瘤細胞增殖活性的研究［J］.暨南大學學報：醫學版，2007，28（2）：136－141

［14］Nakae T，Kometani T，Nishimura T，et al.Preparation of glyceroglycolipids from pumpkin and their effects on polymorphic transformation of cocoa butter.Food Science and Technology Research，2000，6（4）：263－268

［15］王雪玲，繆莉，董昆明，等.海洋細菌抗腫瘤活性菌株的篩選與鑒定［J］.揚州大學學報：農業與生命科學版，2012，33（2）：18－22

［16］曹學麗.高速逆流色譜分離技術及應用［M］.北京：化學工業出版社，2005：48－49

［17］ZHA Zha－jun，YUE Jian－min.New glyceroglycolipid and ceramide from Premna microphylla［J］.Lipids，2003，38（12）：1299－1303.