一種快速檢測食用油中黃曲霉毒素B1的膠體金試劑板的研制

陳笑笑 桑麗雅 李 康 胡葉軍 盛慧萍

（杭州南開日新生物技術有限公司1，杭州 310022）

（杭州市質量技術監督檢測院2，杭州 310022）

黃曲霉毒素（Aflatoxins）是20世紀60年代初發現的一種真菌有毒代謝產物，其基本結構由一個二呋喃環和一個氧雜萘鄰酮組成（即香豆素），主要成分包括 6種：即 B1、B2、G1、G2、M1、M2［1－2］。黃曲霉毒素的危害性在于對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中，以黃曲霉毒素B1（AFB1）最為多見，其毒性和致癌性也最強。生產企業如果使用劣質的原料，如發霉的花生、菜籽、玉米等生產食用油，則有可能造成黃曲霉素超標，對消費者的身體健康造成威脅。

黃曲霉毒素危害性大，存在范圍廣，黃曲霉毒素B1對農產品的污染，不僅影響了農產品質量，嚴重威脅到人民消費安全和身體健康，還降低了農產品的市場競爭力，影響農產品市場聲譽。為了預防黃曲霉毒素中毒事件的發生，維護人類健康，幾乎所有國家和地區都規定了農產品、食品和飼料中AFB1的最大允許含量，并作為強制性檢測項目［3－4］。

目前，測定食品中黃曲霉毒素的方法有薄層層析法、液相色譜法、放射免疫分析法、酶聯免疫法、免疫層析法、微柱篩選法、金標試紙法等。這些檢測方法大多需要專門的儀器設備并且操作繁瑣，無法滿足現場快速檢測的要求，而且檢測成本較高。自乳業中被檢出黃曲霉毒素M1事件后，據質檢總局公布的食用植物油產品抽查情況，廣州、深圳等多家食用油廠家生產的食用油產品被檢出致癌物質黃曲霉毒素超標。因此，建立簡單、快速、高效的食用油中AFB1檢測方法具有重要的意義。［5－6］

本試驗以單克隆抗體（McAb）和免疫膠體金標記技術（ILT）為基礎，研制了一種食用油中AFB1免疫膠體金快速檢測試劑板，可一步式定性測定食用油中AFB1。試劑的靈敏度等性能優于現有的黃曲霉毒素免疫膠體金快速檢測試劑，具有簡單、快速、靈敏度高、無須輔助儀器設備等優點，適用于大量樣品的初步篩選和現場快速檢測。［7］

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

BioJet XYZ3000型點膜儀：美國BioDot公司；硝酸纖維素膜（NC）、膠體金結合墊、樣品墊、吸水墊：Millipore公司；Bradford蛋白定量試劑盒：Bio－Rad公司；黃曲霉毒素ELISA檢測試劑盒：美國Beacon公司；酶標微孔：美國Corning公司。

1.1.2 藥品和試劑

氯金酸（HAuCl4·4H2O）、黃曲霉毒素 B1標準品、羊抗鼠IgG：Sigma公司；甲醇、正己烷：華東醫藥有限公司；黃曲霉毒素 B1－牛血清蛋白偶聯物（AFB1－BSA）、抗黃曲霉毒素單克隆抗體：杭州南開日新生物技術有限公司實驗室。

1.2 方法

1.2.1 黃曲霉毒素B1特異性結合抗原的制備及鑒定

1.2.1.1 通過衍生化反應，合成AFB1羧甲基活化物

10 mg AFB1溶于6 mL［（V（甲醇）∶V（水）∶V（吡啶）＝4∶1∶1）］混合液中，加入 20 mg羧甲基羥胺半鹽酸鹽，85℃回流3 h，室溫放置過夜，旋轉蒸發儀減壓蒸除溶劑。

所得沉淀物用少量氯仿溶解，以V（氯仿）∶V（甲醇）＝9∶1為展開劑，與標準AFB1的展開值Rf進行對照，Rf值為0.25左右的是AFB1的活化物，Rf值為0.75左右的組份是沒有轉化的AFB1，收集活化物組份，待第二次薄層層析進行純化。收集AFB1活化物，用少量的甲醇溶解，待用。

1.2.1.2 利用碳二亞胺法合成AFB1完全抗原

取AFB1活化物5 mg于5 mL的磨口燒瓶中，加5 mL無水二甲基甲酰胺（DMF）溶液使其溶解，置于4℃冰箱中冷卻，取50 mg碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）溶于1.0 mL蒸餾水中，取44 mg BSA溶于4.0 mL 0.01 mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，冰箱中冷卻待用。

在磁力攪拌的同時，將0.5 mL EDC溶液逐滴加入AFB1溶液中，4℃攪拌。避光反應1 h。在反應液中緩慢滴加BSA溶液，繼續攪拌反應1 h后，再加入0.5 mL EDPC溶液，4℃下反應16 h。將產物溶液用0.01 mol／L PBS溶液在4℃下透析72 h，每12 h換透析液1次，用小瓶分裝，真空冷凍干燥后，置4℃保存。1.2.1.3 抗原的鑒定

合成的黃曲霉毒素特異性結合抗原（AFB1－BSA）稀釋成100μg／mL（蛋白質量濃度），然后做200～400 nm波長的紫外掃描。比較半抗原、載體蛋白和偶聯物的紫外光譜圖，判斷偶聯是否成功。

1.2.2 抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體的制備按常規方法制備［8］。

1.2.3 金標抗體的制備

1.2.3.1 膠體金溶液的制備

檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液：取0.01%氯金酸水溶液100 mL用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉水溶液2.5 mL，繼續攪拌加熱10 min，溶液呈透亮的紅色。室溫冷卻，用去離子水恢復到原體積，4℃保存備用。

1.2.3.2 黃曲霉毒素B1單克隆抗體的標記

取已制備好的膠體金溶液100 mL，用0.1 mol／L碳酸鉀溶液調pH到8.0。邊攪拌邊加入黃曲霉毒素B1單抗2 mg，攪拌15 min，逐滴加入2.5 mL 25 mg／mL聚乙二醇 20 000（PEG 20 000），攪拌 20 min。20 000 r／min離心20 min，棄上清液，加入 10 mL pH 7.4 PBS緩沖液（含0.4 mg／mL PEG）清洗2次。將沉淀用5 mL質量分數為2%BSA的PBS緩沖液（pH 7.4）溶解，用0.22μm無菌過濾器過濾后，4℃保存備用。

1.2.4 T線、C線工作濃度的確定及C線、T線、金標抗體包被量配比的確定

1.2.4.1 T線工作濃度的確定

將包被抗原AFB1－BSA用稀釋液稀釋成系列工作濃度，按常規噴量1.0μL／cm包被到NC膜上作為T線，同時將羊抗鼠IgG稀釋成1.2 mg／mL按常規噴量1.0μL／cm包被到NC膜上作為C線，上述NC膜烘干后與膠體金結合墊等組裝成試紙條，用0.01 mol／L pH 7.4的PBS滴定，觀察T線顯色強度及顯色穩定性情況，通過對T線的工作濃度的粗調至細調，最終確定T線的工作濃度范圍。

1.2.4.2 C線工作濃度的確定

根據T線工作濃度范圍，將羊抗鼠IgG設置系列濃度按常規噴量1.0μL／cm包被到NC膜上作為C線，與膠體金結合墊組裝后，用PBS液滴定，選擇C線顯色深度適中、比T線略淺或與T線一樣深的濃度作為C線工作濃度。

1.2.4.3 C線、T線、金標抗體包被量配比的確定

在T線工作濃度范圍內，選擇一個適中濃度按常規噴量1.0μL／cm包被到NC膜上作為T線；將確定的C線工作濃度以常規噴量1.0μL／cm包被到NC膜上作為C線；將金標抗體包被到金標微孔中，包被量在0.8～2.0μL／cm范圍內設置系列濃度；上述材料組裝成試紙條后，用PBS液和不同濃度的黃曲霉毒素B1標準品液滴定，根據顯色情況和試紙靈敏度，選擇適宜的金標抗體包被量。

確定了金標抗體包被量后，再細調C、T線包被濃度配比，最終確定C線、T線及金標抗體的包被量配比。

1.2.5 試劑板各組分的優化、組裝

用點膜機把適當濃度的AFB1－BSA及羊抗鼠IgG噴在NC膜上，分別作為檢測線（T）和控制線（C），在33℃烘箱干燥12 h。將制備好的金標記抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體包被到微孔中，33℃烘箱干燥12 h。

檢測試劑板由PVC背襯，及其上按順序黏著的樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊（圖1）組成。用切割機將貼好的板切割成3.84 cm寬的條，裝入模板中制成檢測試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。

圖1 黃曲霉毒素免疫膠體金快速檢測試劑板結構示意圖

1.2.6 試劑板的操作方法

1.2.6.1 樣品制備

樣本處理過程：吸取1 mL食用油于5 mL離心管中；加入1 mL正己烷和1 mL甲醇，劇烈震蕩1 min，靜置1 min（明顯分層）；吸取0.5 mL上層溶液于一新的5 mL離心管中，60℃下空（氮）氣吹干。向吹干的離心管中加入2.5 mL黃曲霉毒素B1專用復溶液，沖洗管內壁，充分溶解殘留物后，待檢。

1.2.6.2 使用方法

吸取100μL待檢樣品溶液于已包被了金標的微孔中，用滴管吹打均勻，靜置反應5 min，吸取全部混合溶液于試劑板加樣孔中，加樣后開始計時，結果應在5～8 min讀取，其他時間判讀無效，讀取結果時，試劑板應置于觀察者正面，如圖2右側所示。

圖2 試劑使用方法

1.2.6.3 結果判定

當檢測試樣滴于加樣孔時，由于毛細作用液體向前移動。到達T線時，試樣中的黃曲霉毒素B1與固定在T線上的AFB1－BSA復合物競爭結合抗黃曲霉毒素B1單抗－膠體金復合物，可出現以下幾種情況（圖3）。

圖3 陰陽性結果判定圖

1.2.7 試劑板靈敏度的測定

添加黃曲霉毒素B1標準品溶液制備成不同質量濃度的分析試樣溶液：0、0.2、0.5、1、2、3μg／L，用檢測試劑進行測定，每個試樣做3個平行樣，5 min后觀察結果。

1.2.8 試劑板特異性的測定

將黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素分別溶于PBS緩沖液（pH 7.4，0.01 mol／L），各配成5、10、20、50、100μg／L的質量濃度，然后用檢測試劑板檢測。

1.2.9 試劑板假陽性率和假陰性率測定

經HPLC法［9］檢測為黃曲霉毒素B1陰性（黃曲霉毒素B1含量均小于0.1μg／L）和陽性添標樣品（黃曲霉毒素B1含量均大于0.5μg／L）的食用油樣品各50份，用本研究制備的試劑板進行測定，比較檢測結果。

1.2.10 試劑板穩定性測定

用來自同一批次中的不同檢測試劑板檢測同一樣品，比較檢測結果。

將相同批次的試劑板分別于33℃、室溫、4℃密閉保存3個月，每隔2周分別檢測陽性和陰性水產樣品各20份。

1.2.11 試劑板與儀器方法的比對

將10份不同的油樣用本研究制備的試劑板進行檢測，同時用HPLC法進行對比。

2 結果與分析

2.1 黃曲霉毒素特異性結合抗原的鑒定

AFB1、BSA和AFB1－BSA的紫外掃描圖譜見圖4。從圖譜分析，偶聯后AFB1－BSA的特征吸收波峰發生偏移，根據吸光度加合性原理，表明偶聯成功。

圖4 AFB1、BSA和AFB1－BSA的紫外掃描圖譜

2.2 檢測試劑板的制備

將不同質量濃度的AFB1－BSA、羊抗鼠IgG、黃曲霉毒素B1單克隆抗體－膠體金復合物分別包被在硝酸纖維素膜和酶標微孔中，反復調試，使最終的靈敏度達到檢測所需的要求。其具體用量如下：黃曲霉毒素B1單克隆抗體－膠體金復合物采用OD值為10（包被量10μL／孔）的包被量，檢測線 AFB1－BSA用量為 0.8 mg／mL（噴量1.0μL／cm），控制線羊抗鼠IgG用量為1 mg／mL（噴量1.0μL／cm）。

試驗結果表明：①采用不同 pH值 5、6、7、8、9、10的樣品墊對試劑板的靈敏度沒有產生明顯影響。②將硝酸纖維素膜用各種不同配比的溶液做封閉，發現試劑條的C、T線顯色都變淺，但對靈敏度和特異性沒有明顯影響，所以最終制備檢測試劑時沒有采用封閉的方案。③經過比較發現，若C、T線的質量濃度和噴量以及抗體－膠體金復合物的OD值相同，采用12μm和5μm這兩種不同孔徑的硝酸纖維素膜，后者做成的試劑板靈敏度更高一些。④在制備好的抗體－膠體金復合物中加入不同比例的蔗糖和海藻糖，會對膠體金復合物從膠體金結合墊上的釋放能力產生影響，在一定范圍內，加入的蔗糖和海藻糖的比例越高，膠體金復合物釋放得越快。

采用半抗原偶聯率比較高的AFB1－BSA做成的試劑板靈敏度更高，這同偶聯比率高的AFB1－BSA與黃曲霉毒素B1單克隆抗體－膠體金復合物發生反應的能力更強有關。但如果半抗原偶聯率過高，則會出現線條過細，顯色梯度不明顯，跑板差等現象，不適用于檢測試劑板的研制。

本試劑板采用的檢測操作過程中，對比三氯甲烷、乙腈、甲醇、乙酸乙酯等常規提取劑，發現甲醇的提取效率較高，價格便宜，且毒性及對環境的影響較其他試劑小很多，適用于本試劑板的樣本提取。樣本提取過程盡量避免使用比較昂貴儀器，采取盡可能簡潔的步驟。通過反復試驗，本試劑板最終采用提取、吹干、復溶的提取方法，通過濃縮提高了試劑板的檢測線。針對不同使用者所需的檢測線各異，本方法中可以通過增加復溶液量，降低試劑板的檢出線。根據使用復溶液量的梯度建立試劑板的檢測線梯度，使同一試劑板可以具有不止一個檢測線。

2.3 檢測的靈敏度

不同質量濃度的分析試樣溶液經試劑板檢測，檢測顯色結果如圖5所示，從圖5可以看到隨著添加質量分數的升高，檢測線（T線）顯色強度呈梯度遞減。當試樣中AFB1質量濃度小于0.5μg／L時，檢測線顯色比控制線深或與控制線在肉眼下沒有明顯區別。當試樣中AFB1質量濃度大于等于0.5μg／L時，檢測線顯色比控制線淺。當試樣中的AFB1濃度大于2μg／L時，檢測線完全消失。

由此初步確定，本檢測試劑板對食用油中黃曲霉毒素B1的最低檢測水平（LDL）可達到0.5μg／L。

圖5 不同濃度標準品滴板后顯色變化圖

2.4 檢測的特異性

檢測結果見表1，由表1可知，試劑板只針對AFB1有特異性結合，與其他真菌毒素沒有交叉反應。

表1 黃曲霉毒素B1快速檢測試劑板的特異性

2.5 假陰性率和假陽性率

50份經HPLC法確證陰性的食用油樣品用本研究制備的試劑板檢測，2個樣品檢測結果為陽性，其余48個樣品檢測結果為陰性，故試劑板的假陽性率為4%。

50份經HPLC法確證黃曲霉毒素B1含量大于0.5μg／L的食用油樣品用本研究制備的試劑板檢測，檢測結果顯示均為陽性，故試劑板的假陰性率為0。

2.6 試劑板的穩定性

經驗證表明，不同批次的檢測試劑板測定同一樣品，其檢測限、控制線的顯色時間及顏色深淺和最終結果判讀基本相同。

試劑板分別于33℃、室溫、4℃密閉保存3個月，每隔2周分別檢測陽性和陰性水產樣品各20份，結果顯示隨著時間和溫度的變化，檢測結果均未發生顯著變化。根據33℃下一天相當于室溫下1周計算，本試劑板可以在室溫下保存12個月［10］。

2.7 試劑板與儀器方法的比對結果

10份油樣經本研究試劑板（GICA法）和HPLC法檢測，結果見表2，兩種方法結果一致。

表2 GICA和HPLC檢測結果的比較

3 結論

本研究研制的檢測試劑板，與其他的檢測手段相比，最大的特點是快，可以在20 min內得到結果；整個檢測過程無需接觸毒性很大的黃曲霉毒素；操作方便，可實現單個樣本檢測；檢測成本低廉。作為一種快速篩查檢測的方法，有利于食品中黃曲霉毒素B1的檢測和監控，具有重要價值。

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