伏馬毒素生物合成和降解的研究進(jìn)展

徐 瑾 伍松陵 常曉嬌 沈 晗 孫長(zhǎng)坡

（國(guó)家糧食局科學(xué)研究院1，北京 100037）

（北京工商大學(xué)2，北京 100037）

伏馬毒素（Fumonisins，F(xiàn)Bs）是由鐮刀菌屬在一定的溫度和濕度下產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物，是一類(lèi)由不同的多氫醇和丙三羧酸組成結(jié)構(gòu)類(lèi)似的雙酯化合物。伏馬毒素廣泛分布在全球各地，是一種非專(zhuān)性，非特異性的一種病原菌。主要分布在以玉米、高粱、小麥為主的農(nóng)作物上，可造成秧苗枯萎，根、莖、種子腐爛等農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。Cetherine等［1］次從串珠鐮刀菌培養(yǎng)液中分離出伏馬毒素。除了串珠鐮刀菌以外，多譽(yù)鐮刀菌（F．proliferatum）、還有蕪菁狀鐮刀菌（F．napiforme）、花腐鐮孢菌（F．a(chǎn)nthophilum）、尖孢鐮刀菌（F．oxysporum）、F．nygamai、和F．dlamini也會(huì)產(chǎn)生伏馬毒素。目前，除了鐮刀菌屬以外，交鏈胞屬F．varsubglutinans也是伏馬毒素的重要產(chǎn)生菌。而部分鐮刀菌屬的包括膠孢鐮刀菌（F．subglutinans）、F．a(chǎn)nnulatum、F．succisae和F．beomiforme在內(nèi)的菌種不產(chǎn)伏馬毒素［2］。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素有 FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4、FP1共 11種，但其分布主要以 FB1、FB2和 FB33種形式存在，其中FB1是危害范圍最大和研究最廣的伏馬毒素［3］，伏馬毒素的主要化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 伏馬毒素的主要化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

FB毒素能在較低的濃度范圍內(nèi)干擾植物正常生理功能，是對(duì)植物代謝有毒害作用的非酶類(lèi)化合物，屬于真菌毒素（mycotoxin）和非寄主專(zhuān)化型毒素（non－h(huán)ost－specific toxin，NHST）［4］。伏馬毒素 B1對(duì)畜禽和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可引起各種具有特異性的毒理作用，如馬、兔的腦白質(zhì)軟化癥（ELEM），其表現(xiàn)為：神經(jīng)性中毒，意識(shí)障礙、失明和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀，嚴(yán)重者甚至造成死亡［5］。還可造成豬的肺水腫和水胸（PPE），肝臟和食道損傷。伏馬毒素還可引起靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的動(dòng)脈粥樣硬化，鼠、羔羊、小牛的肝細(xì)胞凋亡和腎毒性，還有肝毒性和致癌效應(yīng)，給畜牧業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［6－10］。本文從伏馬毒素理化性質(zhì)、作用機(jī)理及其毒素產(chǎn)生的影響進(jìn)行論述，其中基因工程在伏馬毒素脫毒中的應(yīng)用是本文關(guān)注的重點(diǎn)。

1 伏馬毒素理化性質(zhì)及其作用機(jī)理

1.1 伏馬毒素的理化性質(zhì)

伏馬毒素骨架結(jié)構(gòu)為19或20個(gè)碳原子直鏈的雙酯化合物，各種羧基、羥基及酯鍵分布在骨架兩側(cè)。伏馬毒素溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，且具有熱穩(wěn)定性，100℃蒸煮 30 min也不能破壞其結(jié)構(gòu)［11］，150℃的半衰期為10 min，125℃的半衰期為38 min，100℃的半衰期為175 min，75℃的半衰期為8 h。該特性也給研究工作帶來(lái)困難。

1.2 作用機(jī)理

鞘脂類(lèi)物質(zhì)作為細(xì)胞膜的重要構(gòu)成成分和細(xì)胞功能調(diào)節(jié)劑，在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化中起到重要的作用。由于伏馬毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與人或動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的神經(jīng)鞘氨醇有著高度的相似性，因此在神經(jīng)鞘脂類(lèi)的代謝過(guò)程中，伏馬毒素競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合神經(jīng)鞘氨醇N－2酰基轉(zhuǎn)移酶，從而抑制了神經(jīng)鞘氨醇的生物合成，阻礙了鞘脂類(lèi)代謝［12］。神經(jīng)鞘脂類(lèi)生物合成的破壞將給人類(lèi)以及動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重的危害。Merrill等［13］認(rèn)為FB主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)的方式來(lái)抑制神經(jīng)鞘氨醇N－2酰基轉(zhuǎn)移酶，打破血清、肝、腎中二氫鞘氨醇（Sa）與鞘氨醇（So）之間的平衡，導(dǎo)致復(fù)合鞘脂減少和游離二氫神經(jīng)鞘氨醇增加，影響鞘脂的代

圖2 鞘脂類(lèi)的代射途徑和伏馬毒素的作用位點(diǎn)及復(fù)合鞘磷脂的結(jié)構(gòu)

謝，致使神經(jīng)鞘氨醇生物合成被抑制，最終造成細(xì)胞的損傷。伏馬毒素可通過(guò)鞘脂類(lèi)物質(zhì)參與多種細(xì)胞調(diào)控功能，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)疾病的產(chǎn)生，如：蛋白激酶C的抑制，磷酸化酶D的激活及轉(zhuǎn)錄因子AP－1的增加等。復(fù)合鞘磷脂參與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，影響蛋白的運(yùn)輸、分類(lèi)和定位，及其他與細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、分化和程序化死亡有關(guān)的調(diào)控功能。因此，伏馬毒素可以引起鞘脂類(lèi)代謝紊亂及脂類(lèi)合成失控，同時(shí)還可以影響細(xì)胞分化等，如圖3所示。

圖3 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物功能區(qū)示意圖

2 伏馬毒素合成的調(diào)控因素

2.1 基因調(diào)控因素

生化分析表明，伏馬毒素是鐮刀菌屬產(chǎn)生的次級(jí)毒性代謝產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)參與伏馬毒素生物合成的多酮肽合成酶（PKS）基因，進(jìn)行PCR擴(kuò)增［14］。其結(jié)果為：一個(gè)具有718kb編碼區(qū)的基因（fum5）其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（fum5p）與細(xì)菌和真菌Ⅰ型（TypeⅠ）多酮肽合成酶（PKS）非常相似。攜帶fum5的黏粒克隆轉(zhuǎn)化給串珠鐮刀菌，加強(qiáng)了這些菌株產(chǎn)生伏馬毒素的能力，并且使不產(chǎn)生伏馬毒素的突變株恢復(fù)了野生型產(chǎn)生伏馬毒素的能力。反之，阻斷fum5，則幾乎不產(chǎn)伏馬毒素。有研究表明，fum5p可能催化伏馬毒素C—3到 C—20骨架的合成［15］。盡管 fum5p與脂肪酸合成酶相似，但由于其在一條單鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上具有6個(gè)公認(rèn)的功能區(qū)KS、AT、DH、ER、KR和ACP（其結(jié)構(gòu)示意圖，如圖2），而在真菌脂肪酸鏈上，這6個(gè)功能區(qū)及一個(gè)MPPT區(qū)分布于兩條多肽鏈FAS1和FAS2上，由此推斷fum5p是調(diào)控多酮肽合成酶的基因，非脂肪酸合成酶基因。

2.2 環(huán)境調(diào)控因素

外界環(huán)境條件如，pH值、碳氮比等因素同樣可以影響真菌能否產(chǎn)生伏馬毒素。在輪枝鐮刀菌中，最適合伏馬毒素產(chǎn)生的pH值是3～3.5，pH值高于3.5能促進(jìn)輪枝鐮刀菌生長(zhǎng)但抑制伏馬毒素的生物合成。此外，外界環(huán)境的碳氮比在伏馬毒素生產(chǎn)調(diào)控上也具有重要作用。分析表明，外界糖濃度的增加有利于伏馬毒素的生物合成［16－17］。相反，氨基酸，氮源的增加則抑制伏馬毒素生物合成，將氨基酸的濃度從10 g／L降低到1 g／L時(shí)，伏馬毒素產(chǎn)量顯著增加；當(dāng)改用銨鹽作為氮源時(shí)，同樣表現(xiàn)為高濃度抑制伏馬毒素的產(chǎn)生［16］。伏馬毒素的產(chǎn)生隨著碳氮比的增加而增多，真菌自身的生長(zhǎng)下降［17］。基因分析表明，在低氮的條件下，fum1和fum8等FUM家族基因表達(dá)水平明顯增加，這進(jìn)一步驗(yàn)證了在氮缺乏情況下，更容易誘導(dǎo)FUM基因的表達(dá)，從而增加伏馬毒素的產(chǎn)量［16］。此外，環(huán)境中支鏈淀粉含量也是影響輪枝鐮刀菌伏馬毒素合成的重要因素，高支鏈淀粉含量有利于伏馬毒素的產(chǎn)量增加［18］。

3 伏馬毒素生物合成基因序列群及其表達(dá)

到目前為止，在輪枝鐮刀菌基因組中，共鑒定出16個(gè)FUM基因族類(lèi)基因。在合成伏馬毒素的基因調(diào)控途徑上，在fum1的下游，還具有10個(gè)相關(guān)FUM基因家族類(lèi)基因參與調(diào)節(jié)伏馬毒素合成酶的活性，從而調(diào)控伏馬毒素產(chǎn)量，（見(jiàn)圖4［19］，表1）。然而，其余相關(guān)FUM類(lèi)基因的敲除突變體在伏馬毒素合成量上影響較小或沒(méi)有影響，說(shuō)明該基因族在調(diào)控鐮刀菌伏馬毒素生物合成上具有一定的功能冗余。此外，在FUM基因家族以外，一些其他與伏馬毒素產(chǎn)量相關(guān)的基因也正在日益發(fā)掘。例如，AREA、CPP1、FCC1、FST1、FvVE1、GBP1、GBB1等多個(gè)基因均被報(bào)道在伏馬毒素合成和產(chǎn)量上具有重要作用［16，20－26］。表2列出了在輪枝鐮刀菌基因組中除FUM基因家族基因外，已經(jīng)報(bào)道的其他一系列參與調(diào)控伏馬毒素生物合成的基因及其功能。

圖1 以鞘酯單胞菌為例調(diào)控伏馬毒素合成的FUM基因簇序列排列

研究表明，在輪狀鐮刀菌（F．verticillioides）中15個(gè)相關(guān)位點(diǎn)的基因參與FB毒素的合成［27］；其中所有能產(chǎn)生FB毒素的F．verticillioides中都含有FB毒素生物合成所必需的多酮肽合成酶基因fum5。然而，這些基因究竟如何調(diào)控伏馬毒素的合成，并與FUM基因家族之間具有怎樣的調(diào)控關(guān)系和途徑，目前正在進(jìn)一步研究之中。表1、表2為伏馬毒素生物合成基因簇的表達(dá)情況。

表1 FUM基因族參與伏馬毒素生物合成的主要基因及表達(dá)

表2 FUM基因族外輪枝鐮刀菌基因組中參與伏馬毒素生物合成的主要基因

4 伏馬毒素的鈍化和降解

Stefan Heinl等［19］假設(shè)有關(guān) FB1毒素的降解途徑，F(xiàn)B1首先通過(guò)羧酸酶的作用進(jìn)行脫羧反應(yīng)，隨后在轉(zhuǎn)氨酶的作用下產(chǎn)生無(wú)毒的物質(zhì)。如果該假設(shè)能夠成立，那么降解伏馬毒素的進(jìn)程將大大加快。Duvick等［28］曾報(bào)道了發(fā)現(xiàn)幾個(gè)微生物物種（包括真菌和細(xì)菌）能代謝伏馬毒素碳鏈骨架產(chǎn)生 CO2，如黑酵母菌可以在以FB1作為唯一碳源時(shí)生長(zhǎng)并產(chǎn)生代謝FB1的酶。Blackwell等發(fā)現(xiàn)斯平尼弗外瓶柄霉（Exophiala Spinifera）的純培養(yǎng)時(shí)能分泌細(xì)胞外酯酶轉(zhuǎn)化FB1為氨基酸多元醇［29］。此外，利用現(xiàn)代生物技術(shù)，通過(guò)基因克隆、基因修飾等相關(guān)操作也可實(shí)現(xiàn)降毒甚至脫毒的可能。如：斯平尼弗外瓶柄霉已經(jīng)用作構(gòu)建能脫毒伏馬毒素的轉(zhuǎn)基因玉米。斯平尼弗外瓶柄霉能分泌針對(duì)伏馬毒素的可溶性酯酶對(duì)伏馬毒素進(jìn)行脫酯反應(yīng)，接著由胺氧化酶對(duì)產(chǎn)生的胺醇骨干進(jìn)行內(nèi)部環(huán)化，形成半酮縮醇；這樣酯酶，胺氧化酶，及其他下游酶一起構(gòu)成了一種新型的伏馬毒素代謝途徑。并且與脫酯反應(yīng)和脫胺作用有關(guān)的基因也已經(jīng)被克隆了［29］。可見(jiàn)利用生物轉(zhuǎn)化法將伏馬毒素轉(zhuǎn)化成無(wú)毒物質(zhì)存在理論和技術(shù)上的可行性。通過(guò)基因轉(zhuǎn)化，將新的基因插入作物的遺傳物質(zhì)，增加其特異性，往往超過(guò)作物間的遺傳變異。通過(guò)抑制毒素的合成或?qū)⒍舅亟到鉃闊o(wú)毒物質(zhì)也是一種減少毒素污染的有效方法。

5 展望

伏馬毒素普遍存在于我國(guó)糧食作物中，對(duì)人畜健康有很大的潛在危害。隨著科技的進(jìn)步，可以通過(guò)物理、化學(xué)以及生物手段對(duì)FUM毒素進(jìn)行脫毒、降毒。由于傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法有一定的局限性，且改變了食品的品質(zhì)，易造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失，歐盟不允許在食品生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)用化學(xué)方法消除真菌毒素。而微生物或酶制劑的降解為成功控制真菌毒素的污染提供了新的思路。生物降解不僅可以高效將毒素轉(zhuǎn)化為無(wú)毒產(chǎn)物、環(huán)保安全，而且生物酶催化方法專(zhuān)一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高。通過(guò)生物技術(shù)途徑，消除真菌污染和毒素的危害已成為當(dāng)今關(guān)注熱點(diǎn)。

采用生物技術(shù)減少FUM的危害主要將集中在以下3個(gè)研究方向：一是利用微生物對(duì)真菌毒素的降解機(jī)制主要是將真菌毒素作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源進(jìn)行了吸收、轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到降解毒素的目的。此類(lèi)生防菌通過(guò)代謝機(jī)制抑制毒素的產(chǎn)生。二是利用微生物基因工程，篩選降解酶基因、并進(jìn)行鑒定、分離和克隆及其降解酶蛋白的高效表達(dá)。例如將FUM水解酶基因（如PKS）轉(zhuǎn)化大腸桿菌、酵母或其它模式微生物，大量生產(chǎn)PKS水解酶，運(yùn)用于受鐮刀霉污染的玉米和其它糧食脫毒；或用于飼料，飼養(yǎng)家畜，使其在動(dòng)物胃腸道降解飼料中的FUM。最后，利用基因介導(dǎo)，將FUM水解酶基因克隆到玉米或其他禾谷類(lèi)作物，使轉(zhuǎn)化表達(dá)的種子直接降解受鐮刀霉污染谷物上的FUM。將去毒基因轉(zhuǎn)入受害農(nóng)作物，以此提高FUM水解酶基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)新的FUM水解酶基因，必將受到越來(lái)越多研究者的重視。總之，為保證國(guó)家糧食安全，人民身體健康，使用生物技術(shù)手段對(duì)伏馬毒素的脫毒和降毒具有十分重要的意義。

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