響應(yīng)面法優(yōu)化水楊酸比色測(cè)定還原糖的研究

朱凱杰 陸國(guó)權(quán) 張 遲

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，臨安 311300)

DNS比色法即3，5－二硝基水楊酸比色法的測(cè)定原理是3，5－二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與多糖水解的還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物——3－氨基－5－硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈正比[1－2]。因此，可以通過(guò)測(cè)經(jīng)比色后的分光光度值來(lái)測(cè)定還原糖的量，從而間接測(cè)定作物中的淀粉含量。現(xiàn)今，由于此方法的實(shí)用性和準(zhǔn)確性，已被廣泛應(yīng)用，如劉華等[3]對(duì)煙草中的淀粉含量的測(cè)定，陸國(guó)權(quán)等[4]對(duì)甘薯中的淀粉含量的測(cè)定。但是應(yīng)用過(guò)程中存在著各種DNS配方，且測(cè)定結(jié)果存在較大差異[5－7]。因此，為滿足各類作物中淀粉的測(cè)定，確定一種既準(zhǔn)確又方便、快速、經(jīng)濟(jì)的DNS比色法的配方勢(shì)在必行。

本研究從準(zhǔn)確性、實(shí)用性、方便性、快速性、經(jīng)濟(jì)性、安全性等角度，分析并比較了幾種目前常用的DNS配方的實(shí)用效果，通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的DNS配方的比較和篩選，確定一種快速準(zhǔn)確，經(jīng)濟(jì)實(shí)用的DNS配方，并通過(guò)響應(yīng)面的方法對(duì)此配方進(jìn)行了優(yōu)化[8－12]。確定了符合上述要求的最佳配方DNS配方，為各類作物中淀粉還原糖的測(cè)定奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑

3，5－二硝基水揚(yáng)酸(簡(jiǎn)稱 DNS)、氫氧化鈉(NaOH)、酒石酸鉀鈉、苯酚:亞硫酸鈉:丙三醇:上海試一化學(xué)試劑有限公司；0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(準(zhǔn)確稱取100 mg分析純的葡萄糖(預(yù)先在105℃干燥至恒重，用少量蒸餾水溶液后定容至100 mL，冰箱保存使用)；試驗(yàn)所用水為蒸餾水。

1.2 儀器

721－分光光度計(jì):南京凱迪高速分析儀器有限公司；AB104－S標(biāo)準(zhǔn)型分析天平:上海臺(tái)衡儀器儀表有限公；HK135熱恒溫水浴鍋:杭州韓工科技有限公司；容量瓶、滴定管、量筒、燒杯、棕色瓶:上海衛(wèi)程科學(xué)儀器有限公司；移液槍、1 mL吸嘴:北京華匯通科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 DNS試劑配方的最優(yōu)化篩選

配方1:甲液——溶解6.9 g結(jié)晶酚于15.2 mL 10%氫氧化鈉中，并稀釋至69 mL，在此溶液中加6.9 g亞硫酸氫鈉。乙液——稱取255 g酒石酸鉀鈉，加到300 mL 10%氫氧化鈉中，再加入880 mL 1%3，5－二硝基水楊酸溶液。將甲液與乙液相混合即得黃色試劑；貯于棕色試劑瓶中。在室溫下放置7～10 d以后使用。

配方2:稱取6.5 g DNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后移入1 000 mL容量瓶中，加入10%氫氧化鈉溶液260 mL，再加入20 mL丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1 000 mL，充分溶解后盛于棕色瓶中，放置7 d。

配方3:(1)以稱取3，5－二硝基水楊酸(C7H4N2O7)6.3 g，氫氧化鈉21.0 g充分溶解于500 mL蒸餾水中(水先煮沸10 min后冷卻)；(2)加入酒石酸鉀鈉(C4H4O6KNa·4H2O)182.0 g，苯酚(在50℃水中融化)5.0 mL，偏重亞硫酸鈉(NaS2O5)5.0 g，攪拌至全溶，定容至1 000 mL；(3)充分溶解后盛于棕色瓶中，放置10 d。

配方4:酒石酸鉀鈉18.2 g，溶于50 mL蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入3，5－二硝基水楊酸0.03 g，NaOH2.1 g，苯酚 0.5 g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL，貯于棕色瓶中，室溫保存7 d后使用。

配方 5:將6.3 gDNS和262 mL2 mol/L NaOH溶液，加到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結(jié)晶酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容到1 000 mL，放置于棕色瓶7 d后使用。

按上述5種配方配置后，按照方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，并做適當(dāng)修改:取9支大試管，分別加入標(biāo)準(zhǔn)的葡萄糖溶液，加蒸餾水調(diào)節(jié)體積為2 mL，加入1.5 mL的DNS溶液，水浴加熱5 min，立即用流動(dòng)冷水冷卻，加入21.5 mL的蒸餾水，搖勻。在721－100型分光光度儀上520 nm處，以空白溶液為參比，測(cè)定吸光度(注:本試驗(yàn)中每個(gè)吸光度值均重復(fù)測(cè)量3次，取其平均值所得)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出曲線方程。

待上述5條標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制好后，更改葡萄糖的加入量為0.5、0.9、1.3 mL，分別加入5種DNS液，再用上述方法測(cè)定吸光光度值，帶入各曲線方程，算出測(cè)定的葡萄糖值，與標(biāo)準(zhǔn)值相比，計(jì)算誤差，并分析比較。

1.3.2 DNS試劑配方的優(yōu)化

針對(duì)上述5種配方種，選取一種最佳配方，并對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面的優(yōu)化。

測(cè)定方法:以4支大試管為一組，其中一支中加2 mL蒸餾水，另3支分別加入標(biāo)準(zhǔn)的葡萄糖溶液1 mL，加蒸餾水為1 mL，在4支試管都加入1.5 mL的DNS溶液，水浴加熱5 min，立即用流動(dòng)冷水冷卻，加入21.5 mL的蒸餾水，搖勻。在721－100型分光光度儀上520 nm處，以其中的一支空白溶液為參比，測(cè)定吸光度。

1.3.3 新DNS配方的驗(yàn)證試驗(yàn)

按照DNS試劑配方的最優(yōu)化篩選中的方法對(duì)新DNS配方進(jìn)行驗(yàn)證，即對(duì)其進(jìn)行吸光度測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和曲線方程，觀察其符合程度和精確度。

1.3.4 淀粉回收率試驗(yàn)

為檢驗(yàn)新DNS配方的準(zhǔn)確性，進(jìn)行淀粉回收率試驗(yàn)。先測(cè)純淀粉回收率。方法是稱取0.5 g純淀粉，用鹽酸水解，新DNS配方比色法測(cè)定。再測(cè)定甘薯加純淀粉回收率，方法是先稱取0.25 g甘薯及0.25 g純淀粉，混合后用新DNS配方進(jìn)行鹽酸水解－DNS比色法測(cè)定。

1.3.5 新DNS配方對(duì)甘薯的實(shí)際測(cè)定結(jié)果

為檢驗(yàn)其實(shí)用性和精確性，用新DNS配方和標(biāo)準(zhǔn)DNS配方對(duì)20種甘薯中淀粉含量進(jìn)行測(cè)定、比較和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種DNS配方的曲線繪制、曲線方程以及各種DNS配方的絕對(duì)誤差

如圖1所示，其中y1＝1.056 3x1＋0.079 4，R12＝0.999 7；y2＝1.536 2x2＋0.069 1，R22＝0.999 8；y3＝1.047 5x3＋0.098 1，R32＝0.999 7；y4＝2.312 1x4＋0.012 7，R42＝0.986 7；y5＝1.124 5x5＋0.096 2，R52＝0.999 7，分別表示曲線y1、y2、y3、y4、y5的曲線方程，R12、R22、R32、R42、R52表示各配方的試驗(yàn)數(shù)據(jù)與曲線方程之間的吻合程度。R2值越接近1，吻合程度越高，越接近0，則吻合程度越低。

圖1 5種DNS配方的吸光度測(cè)定結(jié)果的曲線圖

表1表示各種DNS配方的絕對(duì)誤差，是指當(dāng)葡萄糖為0.5、0.9、1.3 mL時(shí)分別測(cè)定出吸光度，用測(cè)量的吸光度后帶入各自曲線，重復(fù)3次，取其平均值，得出的絕對(duì)誤差。

由圖1和表1可以分析得出:配方4繪制的曲線，曲線方程均不理想，最后的誤差也最大，與其余4個(gè)配方相差太大，這可能是由于配方4中的3，5－二硝基水楊酸用量過(guò)少導(dǎo)致的誤差偏大，測(cè)定值不精確。而配方1、2、3、5得到的曲線和曲線方程均符合要求，4個(gè)配方最后所測(cè)的誤差也無(wú)顯著性差異。因此，該4種配方的精密度是符合要求的。但考慮到配方1、3、5較為復(fù)雜，所需藥品較多，且考慮到它們都要加入劇毒藥品苯酚，因此，從實(shí)用性、方便性、快速性、經(jīng)濟(jì)性、安全性等角度，選擇配方2進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

表1 各種DNS配方的絕對(duì)誤差

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 DNS用量的影響

在10%氫氧化鈉260 mL，丙三醇用量為20 mL時(shí)，研究不同DNS用量對(duì)吸光度值的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2中可以看出，吸光度隨DNS用量的增大而逐漸升高，當(dāng)DNS用量為7 g之后吸光度值升高相對(duì)緩慢，從節(jié)約能源等方面考慮選擇DNS用量為7 g為宜。

圖2 DNS用量對(duì)吸光度的影響

2.2.2 氫氧化鈉用量的影響

在DNS用量為7 g，丙三醇用量為20 mL時(shí)，研究不同的10%氫氧化鈉用量對(duì)吸光度值的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3中可以看出，吸光度隨氫氧化鈉用量的增大而逐漸升高，當(dāng)10%氫氧化鈉用量為400 mL之后吸光度值升高相對(duì)緩慢，從節(jié)約能源等方面考慮選擇氫氧化鈉用量為400 mL為宜。

圖3 氫氧化鈉用量對(duì)吸光度的影響

2.2.3 丙三醇用量的影響

在DNS用量為7 g，10%氫氧化鈉用量為400 mL時(shí)，研究不同的丙三醇用量對(duì)吸光度值的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4中可以看出，吸光度與丙三醇用量沒(méi)有關(guān)系，故選擇丙三醇用量仍然為20 mL為宜。

圖4 丙三醇用量對(duì)吸光度的影響

2.2.4 放置時(shí)間的影響

在DNS用量為7 g，10%氫氧化鈉用量為400 mL時(shí)，丙三醇用量為20 mL時(shí)，研究不同放置時(shí)間對(duì)吸光度值的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5中可以看出，吸光度值隨放置時(shí)間的增加而逐漸升高，但當(dāng)放置時(shí)間為6 d之后，吸光度值升高相對(duì)緩慢，故選擇放置時(shí)間為6 d為宜。

圖5 放置時(shí)間對(duì)吸光度的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素探索的試驗(yàn)結(jié)果，以10%氫氧化鈉用量、DNS用量、放置時(shí)間3個(gè)因素為自變量，吸光度為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法在三因素五水平上對(duì)DNS配方進(jìn)行優(yōu)化，以找到最優(yōu)DNS配方為目的。根據(jù)Box－Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，中心組合試驗(yàn)的因子及編碼值(表2)。

表2 中心組合試驗(yàn)的因子及編碼值

對(duì)10%氫氧化鈉用量X1、DNS用量X2和放置時(shí)間X3各水平進(jìn)行如下編碼:X1＝(Z1－400)/100，X2＝(Z2－7)/1，X3＝(Z3－6)/1，以X1，X2，X3為自變量，以吸光度Y為響應(yīng)值，中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表3中試驗(yàn)1～14為析因試驗(yàn)，15～20為中心試驗(yàn)。20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)6次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。采用Minitab 15統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸系數(shù)顯著性分析表

對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得吸光度Y對(duì)編碼自變量10%氫氧化鈉用量X1、DNS用量X2和放置時(shí)間X3的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y＝0.565 952＋0.011 658X1＋0.007 911X2＋0.011 525X3－0.005 540X12－0.002 706X22－0.006 258X32－0.003 287X1X2－0.001 137X1X3＋0.003 213X2X3

表5 回歸方程各項(xiàng)的方差分析表

回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗(yàn)來(lái)判定，P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由表4可以看出，方程中X1、X2、X3對(duì)響應(yīng)值的影響為極顯著，而平方項(xiàng)X1X1、X3X3為差異顯著，其余的均為不顯著，表明試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。從表5中可以得出，回歸項(xiàng)、線性項(xiàng)、平方項(xiàng)為差異極顯著，而交互作用不顯著。回歸方程也是高度顯著的，相關(guān)系數(shù)R2＝0.005 925/0.006 493＝91.25%。說(shuō)明響應(yīng)值(吸光度)的變化有91.25%來(lái)源于所選變量，即10%氫氧化鈉用量、DNS用量和放置時(shí)間。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。根據(jù)回歸分析結(jié)果做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖及其等值線圖，以確認(rèn)10%氫氧化鈉用量、DNS用量和放置時(shí)間三因素對(duì)吸光度的影響，結(jié)果如圖6～圖8。

圖6 10%氫氧化鈉用量與DNS用量對(duì)吸光度的響應(yīng)面和等值線

圖7 10%氫氧化鈉用量與放置時(shí)間對(duì)吸光度的響應(yīng)面和等值線

圖8 DNS用量與放置時(shí)間對(duì)吸光度的響應(yīng)面和等值線

從圖6～圖8可以看出，X1和X2的交互作用明顯，即10%氫氧化鈉用量與DNS用量交互作用明顯；而X1與X3，X2與X3交互作用不明顯，即10%氫氧化鈉用量與放置時(shí)間，DNS用量與放置時(shí)間交互作用不明顯。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)回歸方程取一階偏倒數(shù)等于零，整理可得下式。

式(1)、式(2)、式(3)聯(lián)立方程組，解得X1＝0.261，X2＝2.165，X3＝1.451，代入前述的變換公式得到10%氫氧化鈉用量為426.1 mL、DNS用量為9.165 g和放置時(shí)間為7.451 d，但考慮到實(shí)際操作的便利，將DNS配方修正為10%氫氧化鈉用量為426 mL、DNS用量為9.165 g、放置時(shí)間為7 d，在修正條件下，實(shí)際測(cè)得吸光度(均值)為0.612 7，回歸模型預(yù)測(cè)吸光度理論值為0.612 2。實(shí)際測(cè)定值比理論預(yù)測(cè)值高0.000 5。

再對(duì)其進(jìn)行吸光度測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和曲線方程，觀察其符合程度和精確度，見(jiàn)圖9。

圖9 優(yōu)化后DNS配方吸光度測(cè)定結(jié)果的曲線繪制及曲線方程

由圖9可知，其曲線非常理想，R2達(dá)到了0.999 9，是符合要求的，且其精密度是相當(dāng)高的，因此優(yōu)化后效果顯著。

2.5 淀粉回收率試驗(yàn)

為檢驗(yàn)新DNS配方的準(zhǔn)確性，特作了回收率試驗(yàn)。先測(cè)純淀粉回收率。方法是稱取0.5 g純淀粉，用鹽酸水解，新DNS配方比色法測(cè)定。結(jié)果純淀粉5次測(cè)定的回收率分別為 101.24%、100.41%、100.62%、100.53%，100.41%，平均為100.64%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.12%。說(shuō)明純淀粉回收率符合測(cè)定要求。

為測(cè)定甘薯加純淀粉回收率，先稱取0.25 g甘薯及0.25 g純淀粉，混合后用鹽酸水解－DNS比色法測(cè)定。表6結(jié)果表明，鹽酸水解－DNS比色法測(cè)定淀粉回收率97.66%～101.42%，符合甘薯中淀粉測(cè)定所要求的準(zhǔn)確度。

表6 甘薯加淀粉回收率

2.6 新DNS配方對(duì)甘薯測(cè)定結(jié)果

用新DNS配方和標(biāo)準(zhǔn)DNS配方對(duì)20種甘薯中淀粉含量進(jìn)行測(cè)定和比較，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。

由20個(gè)品種測(cè)定結(jié)果可得:新配方比標(biāo)準(zhǔn)配方測(cè)定的結(jié)果平均高約2%，說(shuō)明新配方測(cè)定甘薯中淀粉的含量是符合要求的。

表7 20個(gè)甘薯品種測(cè)定結(jié)果/%

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Box－Benhnken中心組合響應(yīng)面分析法，結(jié)合淀粉回收試驗(yàn)和20個(gè)甘薯品種實(shí)際測(cè)定結(jié)果，確定優(yōu)化后的最佳DNS配方為:稱取9.165 g DNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后加入10%氫氧化鈉溶液426 mL，再加入20 mL丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1 000 mL，貯于棕色試劑瓶中放置7 d后使用。按照此配方制作標(biāo)準(zhǔn)曲線非常理想，其R2達(dá)到了0.999 9，符合要求，且實(shí)際測(cè)定結(jié)果，新配方比標(biāo)配方測(cè)定的結(jié)果平均高約2%，也是符合要求的。

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