IL－HLLME－HPLC法測定酸奶中磺胺類抗生素

張麗媛 王 穎，2 張東杰

（1．黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2．國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

食品中獸藥殘留立法委員會認為獸藥的使用在于保障畜牧業穩步發展、增加畜牧產品供應量、減少因動物疾病而帶來的經濟損失，以及控制人畜共患疾病在動物和人類之間傳播等方面［1］。但過量或違規使用，可造成多種直接和間接的危害，主要表現為變態反應與過敏反應、細菌耐藥性、致畸作用、致突變性作用及致癌作用［2，3］。

歐盟和美國食品藥品管理局已經提出，乳制品中磺胺類抗生素的總殘留量不得超過100μg／kg，強調嬰兒配方奶粉中必須完全不含磺胺類抗生素，中國農業部規定在乳制品中磺胺甲嘧啶和總的磺胺殘留量不得高于25 μg／kg 和100μg／kg［4－6］。目前，乳制品中磺胺類抗生素殘留檢測存在的兩個主要問題：低濃度水平殘留和復雜基質干擾［7］，這就迫切需要建立一種快速、有效、高靈敏度的分析目標分析物的方法。樣品分析成敗的關鍵是樣品的前處理，固相萃取［8，9］、固相微 萃取、基 質 固 相 分 散［10］、分 散 液 液 微 萃 取［11］、濁點萃取［12］等都是新近常用的分析磺胺殘留的樣品前處理方法。一些靈敏度較高的檢測方法也發展起來，例如高效液相色譜法（HPLC）、質譜法［13］等。均相液液微萃取（ILHLLME）是近年來液液微萃取和濁點萃取發展起來的一種新型萃取技術，集采樣、萃取、富集于一體，有機溶劑用量非常少。近幾年來，被稱為“綠色溶劑”的離子液體在分離萃取過程中得到了廣泛的應用。離子液體是由有機陽離子和無機或有機陰離子構成的、在室溫或者室溫附近呈液體狀態的熔融鹽，它完全由離子組成，可以自由調節。用它代替傳統的有機溶劑，可以從源頭上克服有機溶劑揮發性大、毒性強等的缺點；同時離子液體對水和有機物具有結構可調性，具有選擇性溶解能力。本研究擬采用以離子液體為基礎的IL－HLLME技術，結合高效液相色譜法對酸奶樣品中磺胺類抗生素藥物進行分析測定。旨在尋求一種靈敏、綠色的檢測方法。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

1．1．1 主要儀器

高效液相色譜儀：Agilent1200 型，帶有多波長檢測器，美國安捷倫技術有限公司；

Eclipse XDB－C18柱：150mm×4．6mm，3．5μm，美國安捷倫技術有限公司；

超聲振蕩器：KQ2200E型，中國昆山儀器有限公司；

高速離心機：Allegre 64R 型，美國貝克曼公司；

純水凈化儀：Milli－Q 型，法國Millipore公司。

1．1．2 主要試劑

磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲基嘧啶（SMI）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲噁唑（SMZ）：純度均大于98%，美國Sigma公司（化學結構見圖1）；

圖1 磺胺類抗生素的化學結構式Figure1 The chemical structures of sulfonamide antibiotics

乙腈、甲醇：色譜純，美國Fisher公司；

甲酸、磷酸、乙醇、丙酮：分析純，北京化學試劑廠；

1－乙基－3甲基咪唑四氟硼酸鹽（［C2MIM］［BF4］）、1－丁基－3甲基咪唑六氟磷酸鹽（［C4MIM］［PF6］）：純度＞98%，上海成捷化學試劑公司；

1－己基－3甲基咪唑六氟磷酸鹽（［C6MIM］［PF6］）：純度＞97%，上海成捷化學試劑公司；

1－丁基－3甲基咪唑四氟硼酸鹽（［C4MIM］［BF4］）、1－辛基－3甲基咪唑六氟磷酸鹽（［C8MIM］［PF6］）：純度＞99%，上海成捷化學試劑公司；

磷酸銨（NH4PF6）：98%，上海成捷化學試劑公司。

1．1．3 樣品

伊利原味、蒙牛原味、完達山原味、龍丹原味4種酸奶樣品：大慶市某超市。

1．2 試驗方法

1．2．1 標準溶液的配制 磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲基嘧啶（SMI）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲噁唑（SMZ）分別用乙腈溶解，制成500μg／mL的標準溶液，于4 ℃下保存。標準混合溶液濃度為10μg／mL。工作標準溶液通過用乙腈稀釋標準混合溶液獲得，現用現制。

1．2．2 試驗過程 準確移取10mL 酸奶加入10mL 純水，振蕩2 min，混合均勻；取5 mL 混合后的樣品溶液放入10mL的聚四氟乙烯離心管中，依次在離心管中加入20μL磷酸溶液和70μL［C6MIM］［PF6］（萃取劑），混合后強烈振蕩5min。然后加入100μL 的［C4MIM］［BF4］（分散劑），在35 ℃下超聲萃取10min。再準確稱取0．10g的NH4PF6加入到超聲后的樣品溶液中，再次超聲振蕩2min，此時離心管中的溶液形成一個水／分散劑／萃取劑的乳濁液體系，目標分析物迅速地由水相轉移到離子液體相并且達到兩相平衡。平衡后的乳濁液在5 ℃，15 000r／min條件下，離心10min，溶液分層，萃取相沉積到離心管的底部。將上部的水相溶液完全吸除，用50μL 微量注射器將離子液體相完全轉移到1．0mL的離心管中，再用0．1%甲酸的乙腈溶液稀釋到200μL作為目標分析溶液，將此分析溶液均勻超聲2 min，過0．22μm 濾膜后，進行HPLC分析。

1．2．3 色 譜 條 件 色 譜 柱：Eclipse XDB－C18色 譜 柱（150mm×4．6mm，3．5μm）；柱溫：35 ℃；流動相：A（0．1%甲酸的乙腈溶液）和B（pH 3，0．1%甲酸的水溶液），梯度洗脫條件見表1；流動相流速：0．5 mL／min；進樣量：20μL；檢測波長：265nm；參比波長和狹縫寬度分別為360，4nm。

表1 梯度洗脫時間程序Table1 Time procedure of gradient elution

2 結果與討論

2．1 萃取條件的優化

2．1．1 樣品溶液pH 值的影響 由于溶液的pH 值會影響磺胺類抗生素的電離狀態和溶解度，也會影響酸奶樣品中蛋白質的沉淀情況，所以試驗考察樣品溶液的pH 值。在強酸和強堿條件下磺胺類抗生素的溶解度很大，萃取率較低，故選取pH 值在3．0～9．0范圍進行考察。由圖2可知，當pH

表3 樣品分析Table3 Analytical results of samples

3 結論

本試驗建立了基于離子液體的均相液液微萃取方法，并且成功地從酸奶樣品中萃取出4種磺胺類抗生素，方法簡便可行，取得了良好的效果。

1 Reynolds L，Mckee M．Factors influencing antibiotic prescribing in China：An exploratory analysis［J］．Health Policy，2009（90）：32～36．

2 Forti A F，Scortichini G．Determination of ten sulphonamides in egg by liquid chromatography–tandem mass spectrometry［J］．Analytica Chimica Acta，2009（637）：214～219．

3 M J García－Galán，M S Dáaz－Cruz，D Barceló．Combining chemical analysis and ecotoxicity to determine environmental exposure and to assess risk from sulfonamides［J］．Trends in Analytical Chemistry，2009（28）：804～819．

4 Hermo M P，Nemutlu E，Kir S，et al．Improved determination of quinolones in milk at their MRL levels using LC－UV，LCFD，LC－MS and LC－MS／MS and validation in line with regulation 2002／657／EC［J］．Analytica Chimica Acta，2008（613）：98～107．

5 Huang X J，Qiu N N，Yuan D X．Simple and sensitive monitoring of sulfonamide veterinary residues in milk by stir bar sorptive extraction based on monolithic material and high performance liquid chromatography analysis［J］．Journal of Chroatography A，2009（216）：8 240～8 245．

6 張麗媛，姚笛，何瑩，等．固相萃取－高效液相色譜法聯用檢測花椒樣品中的玫瑰紅B［J］．黑龍江八一農墾大學學報，2012（6）：53～57．

7 包錦淵，遲曉峰，董琦，等．分散均相微萃取－高效液相色譜法測定蜂蜜中的磺胺類抗生素［J］．光譜實驗室，2012，3（29）：1 934～1 937．

8 楊方，李耀平，錢疆，等．固相萃取－梯度洗脫高效液相色譜法同時檢測飼料中十三種磺胺類藥物［J］．分析測試技術與儀器，2004，4（10）：234～237．

9 吳平谷，馮靚，王強，等．固相萃取結合高效液相色譜測定雞肉中10 種磺胺類藥物殘留［J］．中國衛生檢疫雜志，2008，11（18）：2 201～2 203．

10 余輝菊，楊曉松，鄭萍，等．基質固相分散－高效液相色譜法測定牛奶中的8 種磺胺類藥物殘留［J］．中國衛生檢疫雜志，2009，1（19）：86～89．

11 段勁生，王梅，孫明娜．基質固相分散在農藥殘留分析中的應用研究進展［J］．農藥，2006，8（45）：508～511．

12 余益軍，孫兆海，于紅霞，等．濁點萃取在環境有機分析中的影響因素及應用［J］．理化檢驗－化學分冊，2008（44）：696～700．

13 王浩，郭啟雷，殷曉燕，等．高效液相色譜－串聯三重四極桿質譜對牛奶中10種磺胺類藥物殘留的同時測定［J］．分析測試學報，2008（27）：137～139．