As（Ⅲ）暴露對紫貽貝抗氧化酶活性和脂質過氧化的影響

李巧梅，王清，于倩，吳惠豐，由麗萍，趙建民

（1.中國科學院煙臺海岸帶研究所 海岸帶環境過程與生態修復重點實驗室，山東 煙臺264003；2. 中國科學院大學 北京 100049）

砷（As） 在自然界中普遍存在，它既有金屬性又有非金屬性，是一種毒性較高的污染物。近年來，砷礦的開采和熔煉、含砷農藥的使用以及用砷化物作原料的工礦企業“三廢”的排放，使得環境中砷污染日趨嚴重。目前，我國近岸海域環境中砷污染狀況也較為嚴峻。據《中國海洋環境質量公報》，2007年至2010年期間，我國主要河流的砷入海排污量分別達到6 000 t、6 183 t、3 918 t 和3 137 t；雖然總體趨勢有所降低，但局部海域的砷污染現象仍非常嚴重（張麗旭等，2005；任景玲等，2009）。海水中的砷通常以可溶的無機態形式存在，另有極微量的來源于海洋生物的有機砷；因此，海水中的砷毒性通常較強（Neff，1997）。目前，國內外的研究主要關注砷的富集作用及水產品中砷殘留對人類健康的潛在危害，而海灣或河口地區較高濃度的砷污染對海洋生物的毒害作用卻少有報道。

紫貽貝作為典型的海洋環境指示生物，具有移動性差和濾食性等特點，易遭受環境污染的暴露。例如，大連灣紫貽貝的無機砷平均殘留量達到1.11 mg/kg（劉廣遠等，1996），閩南沿海紫貽貝總砷含量介于3.7～14.0 mg/kg，無機砷在0.64～1.16 mg/kg 之間（鐘碩良等，2005）。此外，國內外多項研究表明，紫貽貝可高度富集海水中的砷，且其富集程度顯著高于多數海洋生物（張少娜等，2004；Slejkovee，1996；Szefer，2004）。因此，開展砷對紫貽貝的生態毒理效應研究具有較為重要的意義。

本研究通過亞砷酸鈉亞慢性暴露紫貽貝，分別測定鰓和肝胰腺組織抗氧化指標的變化，探討As（Ⅲ） 暴露對紫貽貝抗氧化能力的影響。研究結果可為深入了解砷在海洋貝類體內的毒性作用機制提供參考，并可為我國近海砷污染的生態風險評估和治理決策提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

紫貽貝購自當地水產市場，馴養一周后開始正式實驗。實驗期間保持連續充氣，海水溫度控制在20±1 ℃，定時定量投喂扁藻和三角褐指藻。每天換水一次，換水后重新添加相應濃度的As（Ⅲ）。

亞砷酸鈉（NaAsO2） 購自國藥集團，為分析純制品。配制成5 mg/L 母液后，按實驗暴露濃度進行相應稀釋。SOD、GST、CAT 活性及GSH、MDA 含量的測定采用南京建成生物研究所試劑盒進行。

1.2 暴露實驗

實驗設置包括1 個對照組和3 個處理組，處理組分別采用1、10、100 μg/L （NaAsO2） 進行暴露，對照組未進行任何處理。每個處理組設置3 個重復。暴露30 天后取樣，每個處理組隨機選取6個紫貽貝分別采集肝胰腺和鰓組織，置于液氮凍存，用于后續SOD、CAT、GST 活性及GSH、MDA 含量的測定。

1.3 抗氧化指標的測定

取凍存樣品，加入9 倍體積的Tris-HCl 緩沖液（0.01 M Tris-HCl，0.1 M EDTA-2Na，0.01 M 蔗糖，8 g/L NaCl，pH 7.4），采用IKA 勻漿機完全均質化（12 000 r/m 勻漿兩次，10 s/次）；組織勻漿液經4 ℃，1 000×g 離心10 min 收集上清液。勻漿液的蛋白濃度采用考馬斯亮蘭法測定（Bradford et al，1976），以牛血清蛋白制作標準曲線。

SOD、CAT、GST 活性及MDA、GSH 含量的測定采用南京建成生物研究所試劑盒，參照試劑盒說明書操作。其中，SOD、CAT 和GST 活性單位為U/mg 蛋白，MDA 含量單位為nM/mg 蛋白，GSH 含量單位為mg/g 蛋白。

1.4 數據統計

實驗結果表示為平均值±標準偏差（Mean±S.D.）。使用SPSS 13.0 統計軟件在P=0.05 的置信水平對上述抗氧化指標進行單因素方差分析，并采用Origin 8.0 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 As（Ⅲ） 暴露對紫貽貝肝胰腺抗氧化指標的影響

采用As（Ⅲ） 進行亞慢性暴露時，低（1 μg/L）、中（10 μg/L） 劑量暴露組紫貽貝肝胰腺中的CAT（圖1A）、SOD（圖1B）、GST（圖1D） 活性以及GSH 含量（圖1C） 均較對照組水平有所增加，但并無顯著差異（P ＞0.05）；高劑量暴露組（100 μg/L）肝胰腺MDA 的含量（圖1E） 較對照組顯著升高（P ＜0.05），而中、低劑量組（1 μg/L 和10 μg/L）較對照組水平無顯著變化。

2.2 As（Ⅲ） 暴露對紫貽貝鰓組織抗氧化指標的影響

As（Ⅲ） 對紫貽貝鰓組織CAT 活性（圖2A）和GSH 含量（圖2C） 的影響表明：較對照組水平，低劑量（1 μg/L） As（Ⅲ） 暴露可導致鰓組織CAT 活性顯著升高（P ＜0.05，1.9 倍），GSH 含量略微增加；中劑量暴露組（10 μg/L） CAT 活性和GSH 含量均極顯著升高（P ＜0.01），分別達到對照組水平的2.8 倍和2.1 倍；而高劑量暴露組（100 μg/L） CAT 活性和GSH 含量較對照組水平有所升高但不顯著。

圖1 不同濃度As（Ⅲ） 暴露下紫貽貝肝胰腺CAT、GST、SOD活性以及GSH 和MDA 含量的變化

As（Ⅲ） 對紫貽貝鰓組織SOD（圖2B） 和GST 活性（圖2D） 的影響結果顯示：3 種劑量暴露組均可誘導鰓組織SOD 活性的上升，但較對照組水平無顯著差異（P ＞0.05），此趨勢與As（Ⅲ）對肝胰腺SOD 活性的影響基本一致。對GST 活性而言，低劑量組活性較對照組略微升高，而中、高劑量組水平較對照組則有所降低。

As（Ⅲ） 對紫貽貝鰓組織MDA 含量的影響如圖2E 所示。結果表明，不同劑量As（Ⅲ） 暴露均能導致鰓組織MDA 含量的增加；其中，低、中劑量組MDA 含量較對照組有所升高，但無顯著差異（P ＞0.05），而高劑量暴露組的MDA 含量則極顯著升高（P ＜0.01），達到對照組水平的1.98 倍。

3 討論

目前，有關無機砷對雙殼貝類毒性作用機制的研究相對較少，僅在斑馬貽貝（Dreissena polymorpha） 和淡水貽貝（Lamellidens marginalis） 中有相關報道。此外，其它部分水生生物中也有相關報道，包括櫛水蚤（Asellus aquaticus）、沙蠶（Laeonereis acuta） 和翠鱧（Channa punctatus） 等。

在本實驗條件下，紫貽貝經高濃度As（Ⅲ）（100 μg/L） 暴露30 天時，表征脂質過氧化水平的MDA 含量顯著增加。類似的現象在其它水生動物中也有報道。例如，翠鱧經1 mg/L As（Ⅲ） 暴露7 天可導致機體脂質過氧化水平的顯著升高（Allen et al，2004；Pisanelli et al，2009），沙蠶經50 μg/L砷暴露7 天后，脂質過氧化物（LPO） 含量有所增加（Ventura et al，2011）。但斑馬貽貝在80 μg/L As（Ⅲ） 暴露7 天后，體內脂質過氧化水平基本無變化（Bouskill et al，2006），這可能是由于斑馬貽貝對砷的耐受性較強所致。多數研究表明，亞砷酸鈉可導致生物體多器官的脂質過氧化水平增強，并伴隨組織抗氧化能力的降低（Mosleh et al，2007；Pisanelli et al，2009），表明脂質過氧化很可能是砷毒性作用機制之一（Fernández et al，2012）。

圖2 不同濃度As（Ⅲ） 暴露下紫貽貝鰓組織CAT、GST、SOD活性以及GSH 和MDA 含量的變化

本實驗對紫貽貝肝胰腺和鰓組織抗氧化指標的研究發現，肝胰腺和鰓組織CAT、SOD、GST 活性以及GSH 含量隨As（Ⅲ） 濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢。這可能是由于紫貽貝機體的抗氧化防御體系由低濃度的誘導逐步轉變為高濃度的抑制所致。此外，研究發現，紫貽貝鰓組織抗氧化指標的變化較肝胰腺更為敏感，不同劑量As（Ⅲ） 暴露可導致紫貽貝鰓組織CAT 活性和GSH 含量顯著升高（P＜0.05），而肝胰腺上述指標均無顯著變化。上述現象的產生可能與貽貝鰓組織對砷的富集程度較高有關（Francesconi et al，1999）。類似的現象在淡水貽貝L.marginalis 中也有報道，經1 mg/L As（Ⅲ） 暴露30 d 后，鰓組織GST 和CAT 活性受到抑制，并導致組織發生病理學變化，影響到鰓組織正常的氣體交換、濾食行為以及病原防御等免疫反應（Chakraborty et al，2010；Vidal-L~ián et al，2010）。可見，雙殼貝類鰓組織抗氧化活性的變化有可能成為評估環境砷污染狀況的潛在生物標志物（Box et al，2009；Moraga et al，2005）。

Allen T，Singhal R S，Rana S V S，2004.Resistance to oxidative stress in a freshwater fish：Channa punctatus after exposure to inorganic arsenic.Biological Trace Element Research，98（1）：63-65.

Bouskill N J，Handy R D，Ford T E，et al，2006.Differentiating copper and arsenic toxicity using biochemical biomarkers in Asellus aquaticus and Dreissena polymorph.Ecotoxicology and Environmental Safety，65（3）：342-349.

Box A，Sureda A，Deudero S，et al，2009.Antioxidant response of the bivalve Pinna nobilis colonized by invasive red macroalgae Lophocladia lallemandii. Comparative Biochemistry and Physiology Part C，149：456-460.

Bradford M，1976.A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry，72（1-2）：248-254.

Chakraborty S，Ray M，Ray S，2010.Toxicity of sodium arsenite in the gill of an economically important mollusc of India. Fish & Shellfish Immunology，29（1）：136-148.

Fernández B，Campillo J A，Martínez-Gómez C，et al，2012.Assessment of the mechanisms of detoxification of chemical compounds and antioxidant enzymes in the digestive gland of mussels，Mytilus galloprovincialis，from Mediterranean coastal sites.Chemosphere，87（11）：1235-1245.

Francesconi K A，Gailerb J，Edmonds J S，et al，1999.Uptake of arsenic-betaines by the mussel Mytilus edulis.Comparative Biochemistry and Physiology Part C，122：131-137.

Moraga D，Meistertzheim A L，Royer S T，et al，2005.Stress response in Cu2+and Cd2+exposed oysters （Crassostrea gigas）：an immunohistochemical approach. Pharmacology & Toxicology，141（2）：151-156.

Mosleh Y Y，Palacios S P，Ahmed M T，et al，2007. Effects of chitosan on oxidative stress and metallothioneins in aquatic worm Tubifex tubifex （Oligochaeta，Tubificidae） . Chemosphere，67（1）：167-175.

Neff J M，1997.Ecotoxicology of arsenic in the marine environment.Environmental Toxicology and Chemistry，16（5）：917-927.

Pisanelli P，Benedetti M，Fattorini D，et al，2009. Seasonal and inter-annual variability of DNA integrity in mussels Mytilus galloprovincialis：A possible role for natural fluctuations of trace metal concentrations and oxidative biomarkers. Chemosphere，77（11）：1551-1557.

Slejkovee Z，Byme A R，Smodis B，1996. Preliminary studies on arsenic species in some environmental samples，Fresenius Journal of Analytical Chemistry，354（5-6）：592-595.

Szefer P，Kim B S，Kim C K，et al，2004.Distribution and coassociations of trace elements in soft tissue and byssus of Mytilus galloprovincialis relative to the surrounding seawater and suspended matter of the southern part of the Korean Peninsula.Environmental Pollution，129（2）：209-228.

Ventura J L，Ramos P B，Fattorini D，et al，2011. Accumulation，biotransformation，and biochemical responses after exposure to arsenite and arsenate in the estuarine polychaete Laeonereis acuta（Nereididae） .Environment Science Pollution Resource，18（8）：1270-1278.

Vidal-Linán L，Bellas J，Campillo J A，et al，2010.Integrated use of antioxidant enzymes in mussels， Mytilus galloprovincialis， for monitoring pollution in highly productive coastal areas of Galicia（NW Spain） .Chemosphere，78（3）：265-272.

劉廣遠，韓明輔，陳則玲，1996.中國北方沿岸經濟貝類砷殘留量的調查研究.海洋環境科學，15（1）：23-26.

任景玲，劉素美，張經，2009.黃、東海溶解態無機砷的分布及其季節變化.海洋通報，11（1）：25-35.

張麗旭，任松，蔡健，2005.東海三個傾倒區表層沉積物重金屬富積特征及其潛在生態風險評價.海洋通報，24（2）：92-95.

張少娜，孫耀，宋云利，等，2004. 紫貽貝（Mytilus edulis） 對4種重金屬的生物富集動力學特性研究.海洋與湖泊，35（5）：438-443.

鐘碩良，阮金山，林后祥，等，2011.福建連江縣東南部海域養殖貝類質量安全評估.福建水產，33（2）：1-5.