TGF-β3在臀肌攣縮癥患者中的表達及其作用

許 剛，趙晨光(蘭州軍區烏魯木齊總醫院全軍骨科中心，烏魯木齊 830000;通訊作者，E-mail:zcgxinjiang@126.com)

臀肌攣縮癥(gluteal muscle contracture，GMC)是一種多發于兒童，由多種原因引起的臀部肌肉及其筋膜的纖維變性，繼發髖關節內收、內旋功能障礙，表現特有步態的臨床綜合征。臀肌攣縮癥基本病理變化是間質增生及纖維化，其發病機制尚未完全清楚，注射因素、免疫因素及遺傳因素等可能參與了發病過程［1-4］。轉化生長因子-β3(transforming growth factor- β3，TGF-β3)是一種具有多種生物學作用的細胞因子，參與調控細胞增殖與分化、機體的生長和發育、組織修復、腫瘤發生等生理病理過程［5，6］，最近研究發現 TGF-β3與組織纖維化密切相關［7-9］。為了進一步討論TGF-β3在臀肌攣縮癥中的作用，本實驗檢測TGF-β3在臀肌攣縮癥患者臀肌攣縮帶中的表達水平，并初步探討TGF-β3在攣縮帶形成過程中的作用。

圖1 攣縮帶及攣縮帶旁臀大肌組織中TGF-β3的表達 (免疫組化，×400)Figure 1 Expression of TGF-β3in the fibrotic muscle and the adjacent muscle by immunohistochemistry (×400)

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2011-10～2013-05在我院住院實施臀肌攣縮癥松解術的23例臀肌攣縮癥患者，其中男性10例，女性13例，年齡7-27歲，平均18.6歲?；颊咴谶M行手術時進行取材，取材包括攣縮帶及攣縮帶旁正常臀大肌組織，每份組織分為兩部分，一部分組織用生理鹽水沖洗后立即置于凍存管中在液氮中保存，另一部分組織進行甲醛固定，制作切片后備用。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 TRIzol液購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ購自大連寶生物工程有限公司，TGF-β3單抗購自美國 Santa Cruz公司，SAP試劑盒購自美國Vector公司，PCR引物由北京奧科公司合成，熒光定量PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2.2 實時定量PCR檢測TGF-β3mRNA的表達水平 從液氮中取出標本，研磨后加入1.0 ml TRIzol液提取細胞總RNA，利用逆轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，嚴格按照說明書進行操作。參照Genbank cDNA中的 TGF-β3及內參β-actin基因序列設計引物，TGF-β3上游引物5’-AAGCGGCGTTT-GGCAATATC-3’，下游引物5’-GACGAAGAAGCGGACTGTGT-3’，產物大小212 bp;β-actin上游引物5’-GCCGCCAGCTCACCAT-3’，下游引物 5’-TGCCCACCATCACGCCC-3’，產 物 大 小 153 bp。PCR反應體系包括:10.0 μl SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)、上、下游引物(10 μmol/L)各 2.0 μl、6.0 μl DNA模板。反應條件:95℃ 10 s預變性，95℃ 5 s、61℃ 30 s 40個循環?；虻南鄬Ρ磉_采用2-ΔΔCt分析。其中實驗組ΔCt=目的基因Ct-內參基因Ct，對照組ΔCt=目的基因Ct-內參基因Ct，ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt。

1.2.3 免疫組化檢測TGF-β3的表達 將4 μm厚度的石蠟切片在60℃烘箱中烘烤30 min，二甲苯脫蠟后進行下行梯度酒精中脫苯、水化。切片浸泡于檸檬酸抗原液中進行抗原修復，滴加3%H2O2去離子水阻斷內源性過氧化物酶，然后滴加封閉血清，封閉非特異性抗體。滴加小鼠抗人TGF-β3單克隆抗體(1∶200)，孵育盒中密封，4℃過夜后SAP染色試劑盒常規顯色，顯微鏡下觀察結果并照相，以PBS代替一抗作為空白對照。結果判定:以低倍鏡和高倍鏡分別觀察切片，陽性染色為細胞間質有紅色條索狀物質著色，染色明顯高于背景，根據染色深淺分級［10］:①陽性面積百分率:無顯色記為0分，1%-25%記為1分，26%-50%記為2分，51%-75%記為3分，大于76%記為4分。②染色強度:未著色記為0分，淺紅色記為1分，紅色記為2分，深紅色記為3分。③綜合評分:兩項相加0-1分為(-)，2-3分(+)，4-5分為(++)，6-7 分為(+++)。本實驗最終計數采用雙盲法分別由兩位病理醫師計數，差異超過10%重新計數。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 TGF-β3mRNA表達水平結果

實時定量PCR檢測結果發現TGF-β3mRNA在攣縮帶中的表達水平(1.76±0.63)明顯高于攣縮帶旁臀大肌組織的表達水平(1.28±0.49)，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 TGF-β3的免疫組化結果

攣縮帶中TGF-β3彌漫性分布于成纖維細胞和血管內皮細胞中(圖1，見第1007頁)，其中2例為(+)，16例為(++)，5 例為(+++)，而在攣縮帶旁臀大肌組織中TGF-β3表達量非常少，其中4例為(-)，18例為(+)，1例為(++)。

3 討論

臀肌攣縮癥由Valderrama在1970年首次報道，常發生于兒童，如不及時治療可影響患兒的生長發育。臀肌攣縮癥的發病是一個復雜的過程，共同的基本病理變化是間質增生及纖維化。其發病原因尚未完全清楚，普遍認為與兒童反復肌肉注射有關，此外免疫調節等因素也參與了發病［1-4］。

TGF-β是一種具有多種生物學效應的細胞因子，參與多種生理病理過程，與病理性瘢痕形成、組織器官纖維化有密切聯系［11-14］。TGF-β共有5種亞型或異構體，其中 TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3存在哺乳動物中，其中TGF-β1可以作用于成纖維細胞，促進其合成大量的Ⅰ、Ⅲ、型膠原蛋白、彈性蛋白、整合素、蛋白多糖等多種細胞外基質成分，從而促進創傷愈合及瘢痕形成，是一種重要的致纖維化因子［13，14］。人 TGF-β3的基因定位于染色體 14q24，與TGF-β1有77%的氨基酸同源性，研究證實 TGF-β3通過與TGF-β1競爭轉化生長因子βⅡ型受體(TβRⅡ)可以拮抗TGF-β1的作用，可以減輕瘢痕形成和纖維化［6，14］。我們前期研究發現 TGF-β1在臀肌攣縮帶中的表達增加，可能參與了臀肌攣縮癥的發生發展過程［15］。為了研究TGF-β3在臀肌攣縮癥中的作用，我們利用免疫組化檢測了臀肌攣縮帶中TGF-β3的表達，結果發現攣縮帶中TGF-β3彌漫性分布于成纖維細胞和血管內皮細胞中，呈強陽性，而在攣縮帶旁的臀大肌組織中TGF-β3表達量非常少。同時我們利用實時定量PCR在 mRNA水平上證實TGF-β3在攣縮帶中的表達水平明顯高于自身周圍臀大肌的表達水平。結合本實驗結果及我們前期研究結果［15］，提示臀肌攣縮癥患者臀肌攣縮帶中TGF-β1、TGF-β3上調可能與臀肌纖維化有關，TGF-β1的致纖維化作用與TGF-β3的抗纖維化作用之間的動態平衡參與了肌肉纖維化發生發展過程。

綜上所述，TGF-β3在臀肌攣縮癥患者的臀肌攣縮帶中高表達，TGF-β3可能參與了臀肌攣縮癥的臀肌纖維化過程。進一步研究TGF-β3在臀肌攣縮癥不同發病階段的作用可能為揭示臀肌攣縮癥具體發病機制及生物學治療提供理論依據。

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