天然化合物抗腫瘤活性研究

陳柱文　馮學(xué)軒等

【摘要】 目的：利用MTT法檢測天然化合物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，尋找有抗腫瘤潛力的先導(dǎo)化合物。方法：藥物和細(xì)胞按所需濃度于96孔板中，恒溫培養(yǎng)48 h，加入5μg/ml MTT溶液20μl/孔，4 h后吸棄100μl/孔上清液，加入MTT裂解液100μl/孔，孵育過夜，用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光值，根據(jù)Reed and Menuch法計算IC50值。結(jié)果：在對人肝癌細(xì)胞株HepG2的毒性試驗中，化合物Qiu17、Qiu33、Qiu22對細(xì)胞的抑制率均略低于50%，而陽性對照藥物DDP則有明顯的抑制腫瘤活性。結(jié)論：化合物Qiu17，Qiu33，Qiu22有一定的的抗腫瘤活性作用性。

【關(guān)鍵詞】 天然化合物； 抗腫瘤； MTT

腫瘤通常分為良性與惡性，惡性腫瘤，即為癌癥，長久以來危及著人類的生命健康，病死率居各類疾病之首，占全球人類死亡總數(shù)的12%。目前對腫瘤疾病的治療中，手術(shù)治療和放射治療占有很大比重。但由于腫瘤易出現(xiàn)擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，致使在治療過程中束手無策。目前臨床使用的放射療法和藥物治療由于選擇性較低，殺死腫瘤細(xì)胞的同時對正常細(xì)胞也有著不同程度的殺傷作用，使機(jī)體免疫功能減退、白細(xì)胞下降、免疫球蛋白水平下降而影響免疫功能；藥物治療也存在著巨大的缺陷，大多抗腫瘤藥物具有骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、心肌毒性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性、腎毒性等全身性的毒副作用[1]。長期使用不僅給身體帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)，并且還將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形成多藥耐藥性（MDR）。腫瘤細(xì)胞的耐藥性是化療失敗的主要原因之一，成為藥物治療癌癥的難題，因此研發(fā)新的更好的抗腫瘤藥物是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題。同時，隨著科學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)、分子藥理學(xué)的快速發(fā)展及各個學(xué)科領(lǐng)域的相互滲透，抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)抗腫瘤藥物已進(jìn)入一個嶄新的時代[2]。

1 材料與方法

1.1 儀器 Bio-rad680酶標(biāo)儀，Water Jacketed CO2 Incubator，ClassⅡBiological Safety Cabinets and Laminar Airflow Workstation，熒光倒置顯微鏡（Nikon），單道移液器、多道移液器，槍頭，96孔板、凍存管，血球計數(shù)板（71103），Eppendorf樣品管等。

1.2 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）（中科院上海細(xì)胞庫）。

1.3 藥物及試劑 化合物Qiu17，Qiu22，Qiu33（中科院昆明植物所植化實驗室）；DDP（美國sigma）。改良型RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清，胰酶，MTT液、20%SDS-50%DMF，PBS緩沖液，凍存液等。

1.4 方法

1.4.1 HepG2細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代 將凍存管取出迅速將其放入37.0 ℃的水浴鍋中快速攪拌融化，取出消毒并于超凈臺，用移液器吸出細(xì)胞液1 ml于培養(yǎng)皿中，再用電動加樣器加入9 ml培養(yǎng)液，逐漸稀釋細(xì)胞液，并吹打均勻，放入37.0 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察。待腫瘤細(xì)胞貼比率達(dá)80%～90%時取出已復(fù)蘇細(xì)胞，吸盡上清，加入1 ml PBS進(jìn)行潤洗，吸盡PBS，加入1 ml胰酶進(jìn)行消化，2～3 min后鏡檢原先貼壁的細(xì)胞逐漸變圓，立即吸盡胰酶加入5 ml含10%血清的完全培養(yǎng)液終止消化，吹打均勻后取1 ml于新培養(yǎng)皿中，加入9 ml培養(yǎng)液吹打均勻后培養(yǎng)，傳代4次后取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4.2 細(xì)胞凍存 取對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行消化處理，吸棄胰酶，加入凍存液。貼壁細(xì)胞不需離心直接加入凍存液吹打均勻后用移液器取1 ml細(xì)胞液加入凍存小管；懸浮細(xì)胞需離心后用凍存液進(jìn)行重懸再加入凍存管。

1.4.3 MTT法的細(xì)胞毒性試驗

1.4.3.1 接種細(xì)胞 取出裝有HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)皿，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入胰酶進(jìn)行消化。細(xì)胞消化后取培養(yǎng)液4 ml進(jìn)行重懸。重懸吹打均勻后迅速取微量20μl于血球計數(shù)板上，于倒置顯微鏡上進(jìn)行計數(shù)，計算出細(xì)胞懸液的濃度，并取量稀釋至1×105個/ml。

用排槍取細(xì)胞液100μl/孔分別加入新的96孔板中，除邊緣不加，第12列三個孔作為空白對照，只有培養(yǎng)液200μl/孔。另外三個空作為陰性對照只有細(xì)胞液100μl/孔和培養(yǎng)液100μl/孔。邊緣的其余孔分別加入200μl/孔的PBS。細(xì)胞接種完后置于培養(yǎng)箱中8 h，使之貼壁完全。

1.4.3.2 配藥 從-20℃的低溫冰箱中取出事先用DMSO溶解的化合物，融化并稀釋成所需濃度，吸入滅過菌的Eppendorf樣品管中，并標(biāo)記Qiu17，Qiu33，Qiu22，DDP。前三種化合物儲存液與工作液的配比均為4∶496，DDP為72：378。分別將最高濃度的4種待測化合物用移液器轉(zhuǎn)移至96孔板中除邊緣的第11、6列中。每一種藥設(shè)3個復(fù)孔，加藥量145μl/孔，其余孔加入120μl/孔的培養(yǎng)液。5倍梯度稀釋成5個濃度。Qiu17，Qiu33，Qiu22三藥的濃度依次為0.064、0.32、1.6、8、40μM，DDP為0.16、0.8、4、20、100μg/ml。

1.4.3.3 加藥、呈色、比色 用排槍從先前配好藥的96孔板中分別取100μl藥液于貼壁的培養(yǎng)板中，濃度從左往右一次升高，培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT液20μl/孔。小心吸棄培養(yǎng)的上清液100μl/孔，再加入20%SDS-50%DMF于培養(yǎng)箱中培育7～8 h。紫色結(jié)晶充分溶解后取出，搖床上震搖10 min，選擇波長595nm，在Bio-rad680酶標(biāo)儀上測定各孔的光吸收值即OD值，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 檢測報告各孔OD值見表1。

2.2 四種藥物對HepG2的凋亡作用見圖1。化合物Qiu17、Qiu33、Qiu22對細(xì)胞的抑制率均低于50%，有但沒有較為明顯的抗腫瘤的作用，而順鉑（DDP）有明顯的抑制作用。

圖1 四種藥物對HepG2的凋亡作用

3 討論

由檢測報告的數(shù)據(jù)來看，每一種藥物對細(xì)胞均有不同程度的殺傷作用，并且隨著藥物濃度的升高細(xì)胞存活率降低。但是化合物Qiu17、Qiu33、Qiu22對細(xì)胞的抑制率均低于50%，有但沒有明顯的抗腫瘤的作用，而順鉑（DDP）有明顯的抑制作用。通過計算得出IC50值為1.694μg/ml，此濃度在0.8～4 μg/ml的范圍之內(nèi)。IC50即半數(shù)抑制濃度，是指在用藥后存活的細(xì)胞數(shù)量減少一半時所需要的藥物濃度[3]。從表中可以看到，每一種藥物的每一個濃度所對應(yīng)的點的標(biāo)準(zhǔn)差都很小，說明實驗的誤差較小。DDP的圖表中可以看到最高濃度的OD值偏高，理論上濃度越高其抑制率為更強(qiáng)，分析是由于邊緣效應(yīng)的影響，由于在培養(yǎng)48 h的過程中，加入MTT液和MTT裂解液后又培養(yǎng)了7～8 h后，邊緣的溶液蒸發(fā)，顏色加深，導(dǎo)致OD值偏高，然而這并不影響實驗結(jié)果。

總之，新的化合物的分離提取到體外實驗即對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗研究的是藥物篩選的初級階段，大批量的藥物經(jīng)過初篩后，還需經(jīng)過復(fù)篩，重現(xiàn)。藥物研發(fā)及其篩選是一個循環(huán)的過程，不斷發(fā)現(xiàn)新的具有抗腫瘤的化合物，進(jìn)行深入研究，必將給癌癥患者帶來福音。

參考文獻(xiàn)

[1] 甄永蘇.抗腫瘤藥物研究與開發(fā)[M].北京： 化學(xué)工業(yè)出版社現(xiàn)代生物技術(shù)與醫(yī)藥科技出版中心，2009：9.

[2] 韓闖，楊勝昌.高通量篩選技術(shù)及其應(yīng)用EJ[J].生物技術(shù)通報，2007，22（2）：20.

[3] （英）R.I.弗雷謝尼著；章靜波，徐存拴等譯. 動物細(xì)胞培養(yǎng)：基本技術(shù)指南[M].北京：科學(xué)出版社，2009：20.

（收稿日期：2012-08-15） （本文編輯：車艷）