利用RAPD技術對牡丹江地區紅松根際土壤微生物多樣性的分析

賈 丹，王 剛，王文帆，陳 迪

(1.黑龍江省森林工程與環境研究所，哈爾濱150081;2.森林可持續經營與環境微生物工程黑龍江省重點實驗室，哈爾濱150081;3.黑龍江省林業科學院，哈爾濱150081)

土壤是巖石圈表面的疏松表層，是陸生植物生活的基質，為植物提供必需的營養和水分。植物的根系與土壤有著極大的接觸面，在植物和土壤之間進行著頻繁的物質交換，彼此有著強烈影響，因此通過控制土壤因素就可影響植物的生長和產量。而在眾多因素當中，土壤微生物因素是最為重要的。

土壤微生物組成復雜［1］，數量巨大，種類繁多，一直被認為是研究中的黑匣子［2］。其中，土壤中的細菌和真菌在生物地球化學循環過程中扮演著非常重要的角色［3－4］，而且對土壤中有機物質的轉換也起著至關重要的作用［5］。土壤微生物還對地表生態系統［6］，對植物的健康［7－8］，土壤的結構［9］，土壤的肥力［10－11］產生重要的影響。

土壤微生物多樣性指生命體在遺傳、種類和生態系統層次上的變化。它代表著土壤微生物群落的穩定性，同時也反映土壤生態機制和土壤脅迫對微生物群落的影響。經研究發現，微生物多樣性豐富的土壤其生態功能也呈現多樣性，且生態系統穩定持續。因此對土壤微生物的多態性及功能的研究會對樹木生理生化的研究及土壤環境的研究提供依據。

目前，針對土壤微生物多樣性的研究，主要為傳統的基于培養分離的方法、土壤酶活性測定、生物標記及分子生物學技術。

隨著人們對土壤中微生物的原位生存狀態研究，越來越發現常規的分離培養方法很難全面地估價微生物群落多樣性。應用現代生物化學和分子生物學方法，成功克服了傳統微生物生態學研究技術的局限性。隨機擴增的多態性DNA(RAPD，Random Amplified Polymorphic DNA)是由 Williams和Welsh在1990年同時提出的一種快速、簡便、多態性檢出率高、可自動化分析的一項DNA分子標記技術［13－14］。RAPD 建立在聚合酶鏈式反應(PCR)的基礎上，以一系列人工合成的不同隨機寡核苷酸序列(l0bp)為引物，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染，或者是通過瓊脂糖凝膠電泳經溴化乙錠(EB)染色來檢測。RAPD技術以檢測多態性DNA為目的，因快速、簡便的特點，其在DNA水平上反映微生物群落的多樣性等方面得到了廣泛的應用，此外也可用于物種分類和親緣關系鑒定、基因組分析等方面。

紅松(Pinus koraiensis)是我國東北山地的地帶性頂級植被類型——紅松闊葉林的優勢樹種。紅松因其樹體高大通直，材質優良而具有很高的經濟價值。最近研究表明紅松的自然分布呈下降趨勢，且土壤微生物功能多樣性正朝著不利于紅松更新的方面進行。研究紅松土壤根際微生物多樣性，可以揭示紅松林土壤結構和肥力等信息，有助于改善紅松林土壤條件，從而更好地保護紅松［15－16］。

1 研究區域概況及土壤樣品的采集

研究區域為穆棱縣，海拔高度在400m左右，地勢多為丘陵漫崗，年平均氣溫2.3℃。平均降水量500～550mm，主要集中在6、7、8三個月。地帶性土壤為暗棕壤。森林植被以中溫帶針葉——闊葉混交林，以紅松為代表樹種，除紅松外還分布著云杉、冷杉、楓樺、椴樹和蒙古櫟等。林下灌木以毛榛子、胡枝子、榛柴、刺玫果和馬林等為主。多年生草本植物以小葉樟為主，伴生有野豌豆、草玉梅和銀蓮子等。

在實驗區范圍內共取了3種林型，分別為椴樹紅松林、云冷杉紅松林和蒙古櫟紅松林，且每種林型中又選取了幼齡、中齡和成熟林共9塊樣地。

在每一個林分內設置(20×20)m2的樣地，并將其按照對角線分為四個小樣地，在每個小樣地挖土壤剖面至母質層。用土壤環刀在紅松根際取3個平行土樣，放入冰箱4℃ 冷藏保存。

2 試驗方法

由于RAPD基于PCR反應，所以PCR反應體系以及PCR擴增程序的確立尤為重要。本試驗通過查閱鄭成木［17］及曹立成［18］等相關文獻，主要對退火溫度進行了優化，最終確定了退火溫度為38℃。具體試驗反應體系如下:

表1 具體試驗反應體系Tab.1 Specific test reaction

3 結果與分析

3.1 RAPD－PCR產物的檢測結果

取8μL PCR產物與6×加樣緩沖液充分混合后，點入TAE為緩沖液的1%的瓊脂糖凝膠中，同時點入DL2000 Marker進行電泳，電泳結束后在凝膠成像系統中檢測PCR結果。其結果如圖1所示。圖1中，標準物為DL2000，1～3道分別為椴樹紅松林幼齡林、中齡林及老齡林。4～6道為蒙古櫟紅松林幼齡林、中齡林及老齡林。7～9道為云冷杉紅松林幼齡林、中齡林及老齡林。且按電泳結果順序將上述9塊樣地編為1#～9#。

圖1 RAPD擴增結果Fig.1 RAPD amplification result

由圖1中顯示，1～3泳道中得到的的條帶最豐富，其次為7～9泳道，4～6泳道條帶最少。由此可以說明，椴樹紅松林中林木根際土壤微生物的多態性最為豐富，云冷杉紅松林其次，蒙古櫟紅松林最底。

3.2 RAPD數據分析

電泳圖譜中的每一條譜帶均代表了引物與模板DNA互補的一對結合位點，記為一個分子標記。根據分子量標準對照反應產物在膠片上的對應位置，對同一引物不同模板的電泳結果進行分析。所有模板都具有的帶為公共帶，表示無多態性;其余為多態帶，表示有多態性。有帶記為1，無帶記為0，形成0/1矩陣圖輸入計算機。用 NTSYS－pc(version 2.10)軟件包中的Nei＆Li法的計算方法分別計算遺傳相似系數。用UPGMA法聚類分析，用NJTREE程序構建樣本間的樹狀聚類圖。

用上訴分析方法得到遺傳系數表(見表2)和聚類分析圖(如圖2所示)。

表2 RAPD遺傳相似性分析Tab.2 RAPD genetic similarity analysis

由表2可知，椴樹紅松林的幼齡林與中齡林和老齡林的遺傳系數分別為0.92和1.00，中齡林與老齡林的遺傳系數為0.92;蒙古櫟紅松林幼齡林與中齡林和老齡林的遺傳系數為0.83和0.83，中齡林與老齡林的遺傳系數為0.83;云冷杉紅松林幼齡林與中齡林和老齡林的遺傳系數為0.75和0.75，中齡林與老齡林的遺傳系數為0.83。

由聚類圖2可知;蒙古櫟紅松林中4#、5#、6#在遺傳系數為0.83時聚成一類;椴樹紅松林的1#與3#遺傳系數完全相同，而與2#在遺傳系數為0.92時聚成一類;云冷杉紅松林中8#與9#在遺傳系數為0.83時聚成一類，而與7#在遺傳系數在0.75時聚成一類。

由聚類分析可知，三種林型在幼齡林階段的1#椴樹紅松林與7#云冷杉紅松林在遺傳距離為0.58時聚成一類，而與4#蒙古櫟紅松林在遺傳距離0.33時聚成一類。中齡林階段的2#椴樹紅松林與8#云冷杉紅松林在遺傳距離為0.58時聚成一類，而與5#蒙古櫟紅松林在遺傳距離為0.33時聚成一類。成熟林階段的3#椴樹紅松林與9#云冷杉紅松林在遺傳距離為0.58聚成一類，而與6#蒙古櫟紅松林在遺傳距離0.33時聚成一類。

4 結論

從以上分析得出結論:椴樹紅松林根際土壤微生物的多態性大于云冷杉紅松林，云冷杉紅松林大于蒙古櫟紅松林。3種林型內的土壤微生物是相互獨立變化的，總體趨勢大致相同。椴樹紅松林與云冷杉紅松林的土壤微生物構成較為近似，與蒙古櫟紅松林的土壤微生物結構較遠。椴樹紅松林在幼齡林時期向中齡林過渡時，土壤微生物結構有細微的變化，到成熟林時又恢復至幼齡林時期的水平。蒙古櫟紅松林在三個時期都在變化，變化的趨勢較無規律。云冷杉紅松林在中齡林和成熟林階段土壤微生物的構成較為相似，與幼齡林時期相差較大。

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