扶正化瘀方對大鼠肝再生過程中cyclinD1影響的實驗研究

張玉果 趙素賢 李建梅 任偉光 李亞 南月敏

前期動物實驗表明扶正化瘀方可提高大鼠肝大部切除后24 h的肝再生速度。本實驗擬進一步驗證扶正化瘀方對大鼠肝再生的影響，采用大鼠肝大部切除(partial hepatectomy，PH)肝再生模型，以促肝細胞生長素(hepatocyte growth promoting factors，pHGF)為陽性對照藥物，研究扶正化瘀方對大鼠肝大部切除后72 h cyclinD1和肝再生的影響，探討扶正化瘀方促進肝再生的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 清潔級雄性Wistar大鼠24只，體重240～280 g，購自河北醫科大學實驗動物學部(合格證號:1201030)。扶正化瘀方藥液為由上海黃海制藥有限責任公司生產的扶正化瘀膠囊用蒸餾水配制成75 g/L。促肝細胞生長素(pHGF)購自長春富春制藥有限公司，批號 H20058141。兔抗人cyclinD1單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。GAPDH、cyclinD1引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒和RealMasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司。

GAPDH上游引物:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，GAPDH下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3';cyclinD1上游引物:5'-GCACAACGCACTTTCTTTCC-3'，cyclinD1下游引物:5'-TCCAGAAGGGCTTCAATCTG-3'。

1.2 動物分組 將雄性Wistar大鼠隨機分為假手術組(對照組)、模型(PH)組、PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組，每組6只。于實驗前3 d至實驗結束，扶正化瘀組給予扶正化瘀藥液灌胃1 ml/100 g，pHGF組給予腹腔注射pHGF 1 ml/100 g，對照組、模型組均給予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 ml/100 g，1次/d。

1.3 造模方法 大鼠自由喂養1周后，術前12 h禁食，術前6 h禁飲，按照秦建民等［1］介紹的方法在無菌條件下操作，用1%戊巴比妥鈉(用量40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，在大鼠上腹部做一個縱形長約1 cm的切口，暴露左葉和中葉，在其根部結扎，切除肝臟左葉和中葉(占70%)，術畢皮下給予0.9%氯化鈉溶液1 ml，縫合切口，消毒。對照組大鼠僅切開腹腔暴露出肝左葉和中葉，隨后送入腹腔，術后自由飲食物和水，術后72 h處死動物，切取全部再生肝組織，稱取濕重。取相同部位肝組織(1.0 cm ×0.5 cm ×0.5 cm)兩塊，一塊以10%甲醛溶液固定，用于肝組織學觀察和免疫組化染色，另塊置于5 ml凍存管立即放入－80℃冰箱保存用于肝組織總RNA提取。

1.4 指標檢測

1.4.1 肝臟再生速度:［C －(A －B)/A］×100%，A=B/0.7，即估計全肝重;B=PH時切除的肝葉濕重;C=處死動物時再生肝臟濕重。

1.4.2 肝組織學檢查:取肝組織經10%甲醛固定24 h后，常規脫水、石蠟包埋，連續切片(厚約4 μm)，經蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光學顯微鏡下觀察肝組織病理學改變。有絲分裂指數:每份標本隨機選取400×視野10個，應用Image-Pro 5.0圖像分析軟件計算每個視野中有絲分裂肝細胞數占肝細胞總數的比例。cyclinD1免疫組化染色并結合圖像半定量分析計算肝細胞核陽性率。

1.4.3 肝組織cyclinD1 mRNA的表達情況:采用熒光定量RTPCR檢測。

1.5 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多個樣本均值間兩兩比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物的一般情況 假手術組PH術后1～2 h即可自由飲水、進食，實驗結束時解剖肝臟如正常肝臟鮮紅色。PH組、PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組術后1～2 h清醒，活動力差，需協助飲水，4～6 h后可自由飲水、進食。4組手術及術后死亡率均為0。

2.2 肝臟再生速度 與PH組比較，PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝再生速度顯著升高(P＜0.05)，而PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表14組PH后72 h肝再生速度n=6，%，±s

表14組PH后72 h肝再生速度n=6，%，±s

注:與PH組比較，*P ＜0.05

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2.3 肝組織學觀察

2.3.1 一般形態學觀察:正常肝小葉肝細胞板排列有序，多為單排，以中央靜脈為中心呈放射狀，肝細胞大小較一致，少數雙核肝細胞，很少見核分裂(圖1)。PH后72 h肝細胞板部分呈雙排，肝細胞明顯增大，肝細胞及核大小不一，小葉中間帶可見多數雙核肝細胞及有絲分裂，間質細胞反應活躍(圖2)。

圖1 正常肝小葉肝細胞板多為單排，以中央靜脈為中心呈放射狀，很少見核分裂(HE×40)

圖2 PH后72 h肝細胞板部分呈雙排，可見多數雙核肝細胞(細箭頭)及有絲分裂(粗箭頭)，間質細胞反應活躍(HE×40)

2.3.2 有絲分裂指數:假手術組很少見到有絲分裂，與假手術組比較，PH組、PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組PH術后3 d有絲分裂指數顯著升高(P＜0.05)，與PH組比較，PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組有絲分裂指數顯著升高(P均＜0.05)，而PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 PH術后72 h 4組有絲分裂指數n=6，%，±s

表2 PH術后72 h 4組有絲分裂指數n=6，%，±s

注:與假手術組比較，*P ＜0.05;與PH組比較，#P ＜0.05

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2.3.3 cyclinD1免疫組化染色:與假手術組比較，PH組、PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1肝細胞核陽性率顯著升高(P＜0.05);與PH組比較，PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1肝細胞核陽性率顯著升高(P均＜0.05)，而PH+扶正化瘀組和PH+pHGF組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 PH術后72 h 4組肝細胞核cyclinD1陽性表達率n=6，%，±s

表3 PH術后72 h 4組肝細胞核cyclinD1陽性表達率n=6，%，±s

注:與假手術組比較，*P ＜0.05;與PH組比較，#P ＜0.05

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2.4 肝組織cyclinD1 mRNA的表達 與假手術組比較，PH組、PH+pHGF和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1表達均顯著升高(P均＜0.05);與PH組比較，PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1表達均顯著升高(P均＜0.05)，PH+pHGF組和PH+扶正化瘀組大鼠肝組織cyclinD1表達差異無統計學意義(P＞0.05)。見表4。

表4 PH術后72 h 4組肝組織cyclinD1 mRNA表達情況n=6，±s

表4 PH術后72 h 4組肝組織cyclinD1 mRNA表達情況n=6，±s

注:與假手術組比較，*P ＜0.05;與PH組比較，#P ＜0.05

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3 討論

肝臟再生是一個包括多種細胞增殖，是由多條通路、多種因素共同參與的一種復雜而又精確的生理過程，最終達到肝組織結構的重建及肝功能恢復。近期研究認為一些因素包括因子、藥物等可影響肝臟再生［2，3］。扶正化瘀方由丹參、蟲草菌絲、桃仁、五味子、松花粉和絞股藍等六味中藥組成，既往研究多注重于其抗纖維化作用，對肝再生的影響尚無實驗依據。本研究以肝再生增殖階段重要的細胞因子肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)［4］為陽性對照藥物，比較正常大鼠PH后72 h PH組、PH+pHGF和PH+扶正化瘀組間肝再生速度、有絲分裂指數的差別，表明扶正化瘀方具有同HGF類似的促進肝再生的作用。

大鼠70%肝部分切除后10～14 d可完全恢復缺失肝組織，期間各種細胞迅速有序增殖，剩余的肝細胞大部分在術后24 h達到DNA合成高峰，少部分肝細胞會出現第二次DNA合成［5］。細胞周期素D1(cyclinD1)是G1期進展的限速控制因素，被認為是細胞進入細胞周期G1期的標志，大鼠肝大部切除術后24 h肝細胞核 cyclin D1蛋白表達達到高峰［6］，馬克學等［7］研究大鼠肝再生過程中cyclinD1的動態變化表明PH后72～96 h出現第二次高峰。本研究結果顯示PH+pHGF和PH+扶正化瘀組大鼠PH后72 h肝組織cyclin D1 mRNA和肝細胞核cyclin D1蛋白表達均顯著高于單純PH組，而PH+pHGF和PH+扶正化瘀組間無顯著性差別，表明扶正化瘀方可上調大鼠PH術后72 h肝臟cyclin D1的表達。

綜上所述，扶正化瘀方可上調正常大鼠肝大部切除術后72 h肝細胞cyclinD1的表達，促進肝再生。為臨床醫生解決如何促進肝損傷后肝再生和肝功能恢復提供了新的實驗證據和治療選擇。

1 秦建民，劉淑琴，曾錦章，等.轉化生長因子β1在大鼠肝再生過程中表達變化的實驗研究.中華普通外科雜志，2004，19:180-181.

2 陳國棟，劉玉蘭，尤鵬，等.粒細胞集落刺激因子促進小鼠肝再生的作用.世界華人消化雜志，2006，14:1466-1470.

3 李天興，朱清靜，蔡艷萍，等.大黃對大鼠肝再生過程中cyclinD1影響的實驗研究.中國中西醫結合消化雜志，2010，18:227-229.

4 Ogura Y，Hamanoue M，Tanabe G，et al.Hepatocyte Growth Factor Promotes liver regeneration and Protein Synthesis after Hepatectomy in Cirrhotic Rats.Hepato-Gastroenterology，2001，48:545-549.

5 Michalopoulos GK.Liver regeneration.J Cell Physiol，2007，213:286-300.

6 Jaumot M，Estanyol JM，Serratosa J，et al.Activation of cdk4 and cdk2 during rat liver regeneration is associated with intranuclear rearrangements of cyclin-cdk complexes.Hepatology，1999，29:385-395.

7 馬克學，席興宇，李玉昌.大鼠肝再生中CyclinD1、PCNA的動態變化.河南師范大學學報(自然科學版)，2005，33:97-99.