兔VX2肝癌模型的建立及其影像學特點

曹雪峰，董國禮

(川北醫學院附屬醫院放射科，四川南充 637000)

原發性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，大多數不能進行早期診斷而喪失手術機會［1］，早期發現、早期診斷、早期治療和預防工作顯得尤為重要。現代影像醫學為肝癌的定位、定性、定量、定制治療方案提供了可靠的依據。兔VX2肝癌動物模型與人類原發性肝癌類似，是肝癌影像診斷及介入治療等研究較為理想的動物模型［2］。

1 種植部位的選擇

兔肝左葉位置較固定、表淺，體積明顯大于右葉，且為了避免損傷膽囊或栓塞材料等進入膽囊動脈引起不必要的并發，研究兔VX2肝癌模型多選擇將懸液或組織塊種植于肝左葉［3］。Lee等［4］研究表明肝左葉組超選擇置管成功率明顯高于肝右葉組，肝左葉組腫瘤供血動脈直徑粗于肝右葉組，這更加證明了選擇肝左葉種植的優越性。

2 兔VX2肝癌模型的建立方法

目前常用的兔VX2肝癌模型的建立方法主要分為瘤細胞懸液接種法與瘤塊接種法［5］，包括開腹及經皮穿刺兩種途徑［6-7］。雖然有學者報道在種植兔肝VX2腫瘤細胞懸液后使用瓊脂糖封堵針孔有效減少了腫瘤的異位種植［7-8］，但瘤細胞懸液無論經何種途徑種植均不可避免的引起腫瘤異位種植，且造價昂貴、費時、費力，目前逐步被瘤組織塊接種法所代替。瘤組織塊接種法包括經皮肝穿刺瘤組織塊注入法、開腹直視下瘤組織塊注入法、開腹直視下肝組織內包埋法。經皮肝穿刺瘤組織塊注入法較少應用。國內學者曾報道開腹直視下瘤組織塊注入法和開腹直視下肝組織內包埋法的成瘤率無明顯差異［9］。

2.1 開腹直視下瘤組織塊種植

2.1.1 模型制作的方法 ①開腹直視下肝組織內包埋法:實驗兔全麻后仰臥位固定，上腹部術區脫毛，常規消毒鋪巾，無菌條件下取劍突下偏左1 cm處逐層開腹，暴露肝臟，鹽水紗布保護下用鑷子將肝左葉輕輕拉出體外，選擇肝左葉較厚處用眼科鑷刺破入肝內1 cm形成竇道，將備用瘤塊2～3塊植入竇道底部，并用明膠海綿填塞竇口。確認無出血后回納肝臟，逐層關腹。②開腹直視下瘤塊注入法:開腹同①，通過腹部切口將0.1 mL瘤組織塊懸液注入肝左內葉包膜下實質內［10］，拔針后立即用大小約為1 cm×1 cm明膠海綿塊壓迫約20 s后回納肝臟，逐層關腹。

2.1.2 模型制作的注意事項 首先，要盡量做到無菌操作及術后抗感染治療;其次，取出瘤塊后，應選取邊緣生長旺盛呈魚肉樣組織，并盡量除去肌肉及壞死組織。開腹直視下肝組織內包埋法以明膠海綿填塞竇口，既可避免瘤塊溢出造成腹腔種植，又可使瘤塊種植在靠近較大血管支的肝左葉深部以易于獲得血供。而開腹直視下瘤塊注入法種植，要求注入瘤塊時進針在肝左葉深部，同樣達到使瘤灶易于獲得血供的目的［4］。

2.2 經皮肝穿刺瘤組織塊注入法

2.2.1 模型制作的方法 實驗兔禁食8 h以上，全麻后仰臥位固定，術野剪毛，B超或CT掃描實驗兔肝臟，確定接種部位為肝左葉，并標記穿刺點，消毒鋪巾，刀尖挑開穿刺點皮膚，B超或CT引導穿刺針到達設定位置，固定針鞘，拔出針芯，緩慢注入VX2腫瘤組織塊或瘤組織塊懸液，然后將明膠海綿碎塊置入針鞘內推送填塞竇口。楊國華等［11］用1 mL的瓊脂糖凝膠封堵進針口，有效防止了瘤塊脫離至腹腔或殘留于皮下各層組織。確定接種成功后拔出針具，局部壓迫止血。陳松旺等［12］實驗結果顯示，在超聲引導下經皮穿刺瘤組織塊接種組成瘤體積大于組織塊懸液接種，因此應更多選用組織塊穿刺注入。

2.2.2 模型制作的注意事項 首先，為提高穿刺接種成功率，要求準確測量穿刺點、穿刺的角度及深度，并注意避開血管和膽管。其次，進針要求快，防止瘤塊接種于肝葉之間的空隙中［12］;注射器回吸，體會有無負壓，并觀察有無膽汁及血液成分;注射過程要慢，壓力盡可能小。最后，操作過程中注意無菌紗布反復擦拭針體，確保針體未黏附腫瘤細胞。

2.3 瘤組織塊接種法制作模型比較

開腹直視下瘤組織塊包埋法具有較高的成瘤率及原位種植率，但需要一定的外科手術技術和無菌條件。而采用直視下瘤組織塊注入法則明顯減小了手術切口，縮短了手術時間，對兔肝臟創傷較小，且減少了切口出血及腹壁粘連、感染的幾率，但經注射器推注或用導絲推送腫瘤組織塊等方法，易致瘤塊進入肝動脈或門靜脈而形成肝內播散或早期轉移，魯東等［13］選用了經皮肝穿擴展鞘管代替穿刺針，斜行鈍性刺破肝臟后以針芯推入瘤塊及明膠海綿條，可確保瘤塊大小并完全避免了因穿刺而導致的肝臟破裂出血，并使瘤塊種植于肝葉深部而易于獲得血供，保證了模型制作的成功率。

相較于開腹制模，采用超聲或CT引導下經皮穿刺組織塊注射法復制出的兔VX2肝癌模型無開腹接種法常伴的出血多、損傷大、易麻醉意外致動物死亡等缺點，且具有接種簡便、創傷小及并發癥少等優點。Lee等［14］報道在超聲引導下經皮穿刺注射瘤組織塊組和開腹組的成功率均為100%，但是前者腫瘤的種植率為20.8%，而后者為8.3%，Shi等［15］采用CT引導下經皮穿刺瘤組織塊法建立兔VX2肝癌模型(前期9只、后期20只)，成瘤率分別為81.9%、95%。這些實驗數據研究均表明，經皮穿刺瘤組織塊接法種腫瘤同樣具有較高成功率高，可取代剖腹手術肝腫瘤接種建立兔VX2肝癌模型。

3 兔VX2肝移植瘤的影像學特點

3.1 在CT上影像學特點

CT是肝臟疾病的最主要的影像學檢查方法，目前應用的多層螺旋CT，因其具備掃描速度快、分辨率高、薄層重建等多種特點，明顯提高了小病灶、早期癌癥及小血管病變等疾病的檢出敏感率與診斷率，且可對病灶的變化和遠處轉移情況進行動態檢測。結合CT多期對比劑增強掃描，可確定腫瘤生長的位置、大小、形狀、血供情況及中心有無壞死，用以區分病灶的良惡性、評價腫瘤血管及對療效的反應。兔VX2肝腫瘤在接種成活后呈指數性生長，1周左右時較小，CT難以顯示。2～3周生長最旺盛，體積迅速增大，切面呈實質性，腫瘤組織塊邊緣有大量新生血管生成，在CT平掃上表現為邊緣欠清晰的低密度，少數為等密度，CT增強掃描動脈期腫瘤邊緣明顯環狀強化，強化環多數不完整且厚薄不均，瘤體中心呈低密度灶，瘤灶與周圍肝實質分界清楚，門脈期腫瘤呈低密度，周圍正常肝實質強化明顯。3～4周腫瘤逐漸增大，中心呈典型的低密度壞死灶，周圍強化環不明顯。應用動態CT研究動物肝癌模型中血管隨著時間推移的發展變化情況，可以量化腫瘤生長的動態變化，并應用到為臨床及研究用途的灌注功能成像中［16］。隨著近年來CT灌注成像的進一步完善，通過對肝臟病變血流灌注改變的研究，可用于鑒別良惡性腫瘤，并可評估腫瘤放、化療的療效，可先于影像形態學的變化更準確地判斷腫瘤療效［17］。

3.2 在MRI上影像學特點

MRI掃描具有多參數成像及任意平面成像等優點，對正常和病理狀態下的軟組織有良好的對比度，常規T2WI圖像上可清晰顯示瘤灶，且MRI對瘤灶內出血、壞死區的顯示較為敏感，可對其動態變化及治療后隨訪提供更多信息。MRI掃描顯示瘤灶主體呈長T1、短T2信號，其間可見混雜的短T1、長T2信號的瘤灶出血區和長T1、長T2信號的壞死囊變區，增強后呈邊緣環狀強化。彌散加權成像(diffusion weighted imaging，DWI)圖像呈明顯高信號，邊緣顯示清晰，與周圍肝臟組織對比鮮明。DWI在腫瘤的早期發現、療效評價及預測方面展示出廣闊的應用前景。動態增強磁共振成像(dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI)被認為是抗腫瘤血管藥物有效性評價的非常有前景的生物指標。磁共振灌注成像(magnetic resonance-perfusion weight imaging，MRPWI)能對組織微循環的血流灌注變化進行定量分析，多用來評價兔肝 VX2腫瘤的療效［18］。但因MRI掃描成像序列多，掃描時間長，受兔呼吸運動影響干擾大，因此應特別注意掃描條件的控制。

3.3 在超聲上影像學特點

超聲檢查是一種無放射性損傷的檢查，肝臟聲像圖可直觀的顯示病變內部的回聲特點，可區別占位性病變為囊性、實質性或混合性。并對病灶進行定位和測量，然而對于病變的進一步定性診斷則常需行CT或MRI檢查。彩色多普勒血流顯像(color doppler flow imaging，CDFI)可以直接觀測到腫瘤內血供的動態變化，尤其是彩色多普勒能量圖技術幾乎不受血流速度、血流方向、聲速探測角度的影響，增強了對血流探測的敏感性，明顯提高對瘤灶的檢出率。超聲造影(contrast enhanced ultrasound，CEUS)因其能夠反映腫瘤組織的血流灌注狀態而逐漸得到應用。超聲檢查實驗兔肝左葉內瘤灶呈偏低回聲或等回聲類圓形結節，邊界欠清，部分可見腫瘤內出現低回聲的液化壞死區及較高回聲的干酪樣壞死區，CEUS強化方式呈“快進快出”型。直徑＜10 mm的兔肝VX2腫瘤其周邊部血管較內部相對豐富，CEUS顯示增強前后腫瘤內部血流信號強度差異無顯著性而腫瘤邊緣則呈顯著性差異［19］，彩色多普勒和能量多普勒可見腫瘤周邊及內部血流信號，表現為以周邊血供為主的粗大血管呈弧形包繞，中央血供少，呈星點狀、短條狀，頻譜多普勒顯示瘤周的血供主要為動脈流速曲線，少數為靜脈流速曲線［8］。

3.4 在DSA上影像學特點

肝血管造影是一種創傷性檢查，通過觀察血管狹窄、擴張、移位等改變對肝膽占位性病變進行分析診斷，臨床應用較少，目前肝臟的影像學檢查多采用CT、MRI和超聲。然而肝血管造影在介入性放射學治療前了解腫瘤的血供情況是非常必要的。兔肝VX2腫瘤DSA顯示:供血的肝左動脈擴張，非瘤區肝內動脈分支血管顯示欠清或不顯示，而腫瘤供血動脈與腫瘤染色顯影清晰，勾畫出腫瘤的大小。腫瘤血管主干被瘤體推壓呈抱拳狀、握掌狀，其外周可見從環繞的腫瘤主干血管上分出的腫瘤滋養血管繞行腫瘤，從周邊向中心推進，形成不同厚度的環圈形周邊深染、中心相對淡染的腫瘤染色結節。分支深入腫瘤內部，部分可見“血池征”。

4 組織病理學表現

大體觀察，肝實質內腫瘤呈結節狀，灰白色，無包膜，切面呈灰紅色，魚肉狀，質地較硬，且與周圍正常肝組織分界清楚，其內可見豐富的供瘤血管，隨著腫瘤的生長，瘤體中央常可見黃白色或灰黃色壞死液化成分，光鏡下見腫瘤呈浸潤性生長，間質分界不清，瘤細胞排列紊亂、體積大、形態不規則，核大而深染，形態各異，新生毛細血管豐富。隨時間的推移，瘤灶內間質成分漸增多。

5 兔VX2肝癌模型的應用

VX2腫瘤細胞株以其強侵襲轉移能力，可在新西蘭大白兔的任何內臟、骨骼及軟組織生長，并根據實驗目的及要求的不同，可以采用不同方法建立兔VX2肝癌模型，用以進行肝腫瘤的影像診斷學及治療學的實驗研究。種植2周后，腫瘤生長旺盛，適合進行腫瘤治療學研究，可用MRI檢測術前及術后腫瘤生長情況，而用CT檢測術后碘油栓塞的情況則更為理想;3周后腫瘤中心出現變性壞死，可作為進展期肝癌研究模型，而此階段可獲得較為豐富的影像學;4周后可有肝、肺及遠處轉移，宜作為晚期肝癌動物模型研究。近年來，很多學者進一步完善了兔VX2肝癌模型，并應用兔VX2肝癌模型進行介入放射學、腫瘤治療學、腫瘤影像學、藥代動力學研究，促進了對人類肝癌的診斷及治療［20］。

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