“金絲4號”棗大小孢子發生及雌雄配子體發育

鄒 鋒 ，袁德義 ，段經華 ，廖 婷 ，馮延芝 ，高 超

（1.中南林業科技大學 經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.中國林業科學研究院，北京 100091）

“金絲4號”棗Ziziphus jujubeMill cv ‘jinsi No. 4’原產于山西運城龍居鄉東辛莊一帶，是從“金絲2號”自然雜交的實生棗樹中選育而來，為棗樹中稀有的名貴鮮食品種[1]。“金絲4號”耐瘠薄，適應性強，自19世紀80年代對棗進行良種選育和資源開發利用以來，“金絲4號”已逐步推廣到全國十余個省、市及地區。“金絲4號”以早實、果實特大、皮薄肉厚、清香甜脆、風味獨特著稱，受到人們的重視和消費者的歡迎。其鮮果含糖量22.75%，含酸量0.368%，含Vc 2.92 mg·g-1，可食率達 97.3%，營養豐富，品質上等。

棗樹在林業產業結構調整、山區經濟發展和林產品外貿出口中占有特殊重要的地位，被稱為“木本糧食”、“鐵桿莊稼”[2]。棗在生產中普遍存在結實率低、產量低的現象，這嚴重影響著棗的經濟效益及其產業的發展。目前，關于棗的研究多集中在引種栽培[3]、果實品質[4-5]、病蟲害防治[6]、遺傳多樣性[7]等方面，而關于棗結實率低的生殖生物學因素的研究報道較少[8-13]。植物的有性生殖過程是植物體進行物種延續和種群擴大的根本動力。開花、傳粉、受精、結實，是一個連續的過程，只有從整體的和發育的角度去研究探討，才能找出問題所在。而大、小孢子發生及雌、雄配子體的發育狀況是果樹授粉受精和果實產量形成的基礎。因此，本研究中試圖通過對“金絲4號”棗大小孢子發生及雌雄配子體發育過程進行觀察，為揭示棗結實率低的內在原因提供理論依據，為提高棗產量和品質以及開展雜交育種研究奠定基礎。

1 材料與方法

試驗材料采自中南林業科技大學衡陽棗種質資源圃，試驗地位于東經 112°18′54″、北緯26°54′48″、海拔70.0 m的緩坡丘陵紅壤。試驗地水肥條件良好，采取常規管理方式。

選取正常開花結果的8年生“金絲4號”3株，從2010～2011年每年的4～6月，每3天采樣1次，每次從采樣樹冠中部的不同棗吊的基部選取大小發育情況較為一致的“金絲4號”花芽或花蕾10個，用FAA（70%酒精90 mL、醋酸5 mL、福爾馬林5 mL）固定、抽氣，后轉入70%酒精置于4 ℃冰箱保存備用。石蠟切片方法參考袁德義等[14]的方法，鐵釩-蘇木精染色，曙紅對染，加拿大中性樹膠封片，OLYMPUS BX-51顯微鏡下觀察照相。

2 結果與分析

2.1 花藥壁的發育

從“金絲4號”棗花芽的石蠟切片中可以觀察其花藥壁的發育過程。首先，形成棗花藥原始體；花藥原始體隨后形成孢原細胞（見圖1A），孢原細胞的典型特征是原生質濃厚，形成的場所位于花藥四角；孢原細胞形成之后，通過平周分裂的方式形成2層細胞；初生造孢細胞隨即形成（見圖1B），即孢原細胞分裂而成的2層細胞中里面的1層細胞；外面的1層為初生壁細胞，它經過數次分裂后形成花藥壁，花藥壁形成時為小孢子母細胞時期，花藥壁從結構上分為4層，從內至外分別是中層、絨氈層、藥室內壁、表皮，次生造孢細胞位于絨氈層內 （見圖1C）。另外，絨氈層細胞和中層會隨著發育進程而發生變化。中層在小孢子母細胞開始減數分裂時染色變深開始退化，到“金絲4號”棗花粉成熟時只留下殘跡。在“金絲4號”棗花藥壁發育過程中，絨氈層內含有豐富的營養物質，能夠為小孢子的發育奠定充足的物質基礎，因此在花藥整個發育過程中表現得最為活躍，這與何春燕[15]的研究結果類似。絨氈層在“金絲4號”棗小孢子母細胞處于減數分裂時，其開始徑向加厚（見圖1D）；在“金絲4號”棗進入小孢子四分體時期，它開始出現原位解體現象（見圖1F）；絨氈層在“金絲4號”棗單核小孢子時期，會繼續解體，結果導致與花藥壁的中層剝離（見圖1J、K）；當“金絲4號”棗花粉趨于成熟時，絨氈層開始溶解、退化，直至消失，“金絲4號”棗花藥壁由原來的4層只剩下2層，即藥室內壁和表皮（見圖1O），根據Davis[16]對被子植物花藥壁發育方式的分類，花藥壁發育類型分為簡化型、基本型、雙子葉型和單子葉型4種，“金絲4號”棗花藥壁的發育屬于基本型。Davis[16]根據絨氈層發育后期的形態差別，將絨氈層分為腺質絨氈層和變形絨氈層這2種類型[17]，由于“金絲4號”棗絨氈層的退化、溶解發生之后，因其發生場所位于原位上，所以其核、質也在原位溶解，并沒有發生位置上的移動，從而決定著“金絲4號”棗的絨氈層屬于前一種類型，即為腺質型絨氈層，這與攸縣油茶[18]的絨氈層類似。

2.2 小孢子發生及雄配子體發育

2.2.1 小孢子發生

從花藥的橫切面上看，“金絲4號”的花藥具有4個花粉囊，中間有藥隔隔開，整體形狀呈蝴蝶狀（見圖1C）。由此可見，對于“金絲4號”的幼嫩花藥而言，其結構組成包括初生壁細胞和造孢細胞 （見圖1A、B）。對于造孢細胞，在其發育過程中，會有多次的有絲分裂，并分化形成小孢子母細胞，造孢細胞的特點是細胞體積較大、細胞核較大、細胞質濃厚、無明顯的液泡；初生壁細胞在經過平周分裂和垂周分裂后形成3個細胞層，即藥室內壁、中層、絨氈層，并與表皮一起組成花藥壁（見圖1C）。小孢子母細胞進行2次減數分裂，如減數Ⅰ末期（見圖1D），減數Ⅱ末期（見圖1E），其胞質分裂為同時型，經過2個連續的減數分裂過程后進入四分體時期（見圖1F）。在四分體時期，4個小孢子共處于1個胼胝質（見圖1F）的小孢子母細胞壁內，小孢子四分體為四面體形。

圖1 “金絲4號”棗小孢子和雄配子體的形成和發育Fig.1 Formation and development of microspore and male gametophyte in Ziziphus jujube Mill cv ‘jinsi No. 4’

2.2.2 雄配子體發育

“金絲4號”棗雄配子體發育是從小孢子開始的，隨著小孢子四分體之間的胼胝開始解體、溶解并消失（見圖1G、H），其小孢子逐漸從四分體中游離出來（見圖1I），形成單核小孢子（見圖1J），這標志著其小孢子進入了雄配子體的發育階段，雄配子體階段對于小孢子的發育意義重大，小孢子在從四分體中剛釋放出來時，細胞壁較薄，細胞質濃厚，細胞核處于細胞中央，細胞的體積總體上還比較小（見圖1J）。小孢子在發育過程中從其周圍的組織或器官中汲取營養成分，從而使得花粉粒體積不斷增大（見圖1K），并發育形成核物質（見圖1L），同時小孢子體積繼續增大，細胞質也明顯液泡化，此時形成單核時期小孢子（見圖1M）。小孢子經過一段時期生長發育就會形成3個萌發孔，萌發孔位于小孢子的表面，是供給小孢子營養物質的通道，營養物質的來源是絨氈層（見圖1M）。隨著小孢子不斷地吸收絨氈層的水分和養分，其細胞體積增大，細胞壁加厚并且細胞質液泡化加劇，接著花粉粒的體積明顯增大（見圖1M），逐漸發育成為二核花粉（見圖1N），并充滿淀粉、脂肪等營養物質，最終花粉粒發育成熟（見圖1O）。“金絲4號”花粉為三角形，具3個萌發孔，3溝，成熟花粉為2-細胞型。

2.3 大孢子發生與雌配子體發育

2.3.1 大孢子發生

根據“金絲4號”棗幼嫩花芽橫切面觀察，胚珠原基發生于子房壁的胎座上（見圖2A），孢原細胞由珠心表皮下2～3層細胞分化而來，接著內外珠被伸長發育形成環狀突起（見圖2B）。緊貼珠心表皮分化出來的孢原細胞與相鄰細胞相比體積明顯偏大，核大而明顯，細胞質濃，直接行使著大孢子母細胞的功能（見圖2C）。大孢子母細胞開始進行減數分裂，經過中期（見圖2D）、后期（見圖2E）、末期（見圖2F），胞質分裂為橫向，形成四分大孢子（見圖2G），靠近珠孔端的3個細胞退化，合點端功能大孢子體積增大，繼續進行減數分裂發育形成單核胚囊（見圖2H）。

2.3.2 雌配子體發育

單核胚囊為雌配子體發育的起點，此時其內外珠被已形成。大孢子母細胞進行減數分裂后形成四分體大孢子，四分體大孢子的排列是以直線型的方式（見圖2G），其中功能大孢子位于合點端，二核胚囊的形成源于單核胚囊的1次有絲分裂，2個核由于液泡的推移作用分別移向兩極（見圖2I），并再各進行1次有絲分裂形成四核胚囊（見圖2J），形成四核胚囊后逐漸拉長直至出現大液泡化，隨后形成八核胚囊（見圖2K），途徑仍是通過每個核繼續進行的1次有絲分裂。八核胚囊長期存在，因此斷定“金絲4號”棗的成熟胚囊的完整形態：1個卵細胞、2個助細胞（其珠孔端有大液泡）、2個極核、合點端有3個反足細胞（見圖2L～O）。胚囊形成過程表明“金絲4號”棗為倒生胚珠，雙珠被，厚珠心，胚囊結構為蓼型。

3 結論與討論

3.1 “金絲4號”棗胚胎學特征

“金絲4號”棗的胚胎學特征與已報道的長紅棗[9]、寧夏圓棗[10]、灰棗[13]、酸棗[19]等基本一致。“金絲4號”棗的花藥4室，花藥壁4～5層，分別為表皮、1～2層藥室內壁、中層和腺質絨氈層，花藥壁的發育類型屬于基本型；小孢子母細胞經2次減數分裂后形成四分體，其孢質分裂為同時型，四分體排列多為正四面體；成熟花粉為2-細胞型，其花粉為三角形，具3個萌發孔，3溝。“金絲4號”棗雄配子體發育過程中未發現大量花粉敗育的現象，說明“金絲4號”棗花粉雄性可育，這不是棗子結實率低的原因。倒生胚珠，雙珠被，其珠心類型為厚珠心；大孢子母細胞減數分裂形成4個大孢子，呈線形排列，合點端大孢子發育成為功能大孢子，功能大孢子經有絲分裂后形成成熟胚囊具7細胞8核，胚囊發育為蓼型。但是，有關棗胚囊發育的類型，仍存在爭議。本研究結果顯示，“金絲4號”棗胚囊的發育類型為蓼型，這與Srinivasachar[20]的觀察結果一致，但是Kaiale[21]、田惠橋[10]認為棗胚囊發育類型是蔥型，這種差異的產生可能與不同棗品種的遺傳特性有關，具體原因還有待于進一步研究。

3.2 “金絲4號”棗雌雄異熟現象

植物雌雄異熟性是指1株植株或1朵花中的雌蕊和雄蕊成熟時間不一致或雌雄性功能在時間上的分離[22]。有關學者經研究推測，小孢子母細胞在結構上因有原生質道相連，形成了合孢體，從而在營養運轉、分配等方面形成一個完整的系統，因此認為小孢子母細胞減數分裂是同步完成的[17]，而本研究結果顯示“金絲4號” 棗小孢子母細胞減數分裂不同步，這與油茶[14]類似，分析其原因，一方面可能是品種自身的特性所導致，目前尚未知其它棗品種是否也存在此現象；另一方面可能是營養因素所導致，即胼胝質壁形成過早而堵塞細胞質道，養分的運轉和分配也由此受到了影響。“金絲4號”棗在5月下旬至6月初開花，開花數量多，花期較長，氣溫較高，傳粉

昆蟲較多，這非常有利于其傳粉受精和坐果。高等顯花植物小孢子母細胞減數分裂大量不同步現象及不同藥室、不同雄蕊的發育不同步現象等均是一種有效的延長傳粉期的生殖機制，即雌雄異熟機制[18]。棗為雌雄同株植物，“金絲4號”棗在其雌雄蕊發育時期存在不同步現象，即雌雄異熟，“金絲4號”棗的這種雌雄異熟現象主要表現在雄蕊的發育先于胚囊的形成，這種類型的雌雄異熟現象在油茶[15]和梨[23]上也有發現。由此說明“金絲4號”棗是異花授粉或以異花授粉為主的植物，其雌雄配子體的形成和發育過程正常，這種雌雄異熟機制在植物界中普遍存在，其目的是促進異交或遠交，限制自交或近交所導致的物種衰退或退化[23-24]。

圖2 “金絲4號”棗大孢子和雌配子體的形成和發育Fig.2 Formation and development of megaspores and female gametophyte in Ziziphus jujube Mill cv ‘jinsi No. 4’

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