人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化的誘導(dǎo)與鑒定

胡佳樂(lè) 徐之明 徐立軍 沈紅石 陳海飛 唐杰慶 李征洋 王 靜 吳天勤

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為1種具有很強(qiáng)的自我復(fù)制和多向分化潛能的干細(xì)胞，已成為組織工程、細(xì)胞工程和基因工程理想的種子細(xì)胞［1］。大量實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs在特定條件誘導(dǎo)下，能夠分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、表皮細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞等不同的組織細(xì)胞［2～6］。不過(guò)多為研究大鼠、小鼠、兔等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以人BMSCs為研究對(duì)象的體外誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)還不是很多。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一套簡(jiǎn)便有效的hBMSCs培養(yǎng)方法，觀察hBMSCs表面抗原的表達(dá)以及其多向分化的潛能，為后續(xù)體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 骨髓標(biāo)本來(lái)源

所有骨髓標(biāo)本取自5例尿毒癥患者(尚未進(jìn)行異體腎移植)髂后上棘，年齡18～30歲，平均年齡(24.22±3.36)歲。骨髓來(lái)源均經(jīng)供者同意并簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

低分子肝素(Sigma);胰蛋白酶(Gibeo);Anti-human CD34、CD44、CD105(Biolegend);FITC 標(biāo)記的羊抗兔二抗(Sigma);Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗(Sigma);β-甘油磷酸鈉(Amesco);生長(zhǎng)分化因子5(Sigma);ITS+(Sigma);L-脯氨酸(Sigma);丙酮酸鈉(Sigma);油紅O染色液(Amesco);茜素紅染色液(Amesco);阿利新藍(lán)及核固紅(Amesco);自制無(wú)血清培養(yǎng)體系(本實(shí)驗(yàn)室研制)。

1.3 主要儀器

培養(yǎng)箱(Sanyo);超凈工作臺(tái)(安泰蘇凈);倒置相差顯微鏡(Nikon);細(xì)胞計(jì)數(shù)板(Corning);熒光倒置顯微鏡(Nikon)。

1.4 方法

1.4.1 hBMSCs分離培養(yǎng)及擴(kuò)增 應(yīng)用肝素處理注射器，無(wú)菌條件下從骨髓供者抽取骨髓標(biāo)本，立即放入盛有10 ml上述自制無(wú)血清培養(yǎng)基的透氣孔培養(yǎng)瓶中，并迅速輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，每隔3 d換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征，待細(xì)胞接近80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶2比例傳代。待hBMSCs增殖至第4代(P4代)，將無(wú)菌清潔蓋玻片置于無(wú)菌6孔板中，取生長(zhǎng)良好的P4代hBMSCs進(jìn)行細(xì)胞爬片。

1.4.2 hBMSCs表面抗原的鑒定 采用常規(guī)免疫熒光法鑒定hBMSCs表面抗原。具體步驟如下:①固定，細(xì)胞爬片經(jīng)40 g/L多聚甲醛4℃固定30 min，PBS漂洗去除固定液;②破膜，用0.1%Triton溶液破膜30 min，山羊血清封閉處理;③加一抗，分別滴加1∶100稀釋的抗CD34、CD44、CD105抗體，4℃過(guò)夜;④加二抗，PBS漂洗后，CD34、CD105鑒定加入1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗，CD44鑒定加入1∶200稀釋的Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃避光孵育1 h;⑤封固觀察，PBS漂洗后，應(yīng)用抗熒光粹滅封片劑封固，熒光顯微鏡下觀察鑒定hBMSCs表面抗原。

1.4.3 hBMSCs成脂誘導(dǎo)與鑒定 待細(xì)胞爬片基本融合后，加入成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)［7］(含誘導(dǎo)劑10－7mol/L地塞米松，5 mg/L胰島素，0.5 mmol/L 3-異丁甲基黃嘌呤，60 μmol/L吲哚美辛的自制無(wú)血清培養(yǎng)液)，每3 d換液，連續(xù)誘導(dǎo)21 d，倒置顯微鏡下每天觀察hBMSCs生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。

油紅O染色:①固定，取誘導(dǎo)21 d的細(xì)胞爬片，PBS沖洗后，加入4%中性甲醛，固定60 min;②染色，吸去固定液，加入現(xiàn)配過(guò)濾后的Oil Red O染色液，染色60 min;③鑒定觀察，PBS洗3次，去除殘留的染色液和殘?jiān)@微鏡下觀察脂肪滴的形成并拍照。

1.4.4 hBMSCs成骨誘導(dǎo)與鑒定 待細(xì)胞爬片基本融合后，加入成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)［8］(10－7mol/L地塞米松，2 mmol/L β-甘油磷酸鈉，0.15 mmol/L 維生素C 的自制無(wú)血清培養(yǎng)液)，每3 d換液，連續(xù)誘導(dǎo)21 d，每日在倒置顯微鏡下觀察hBMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和形態(tài)變化。

茜素紅染色:①固定，取誘導(dǎo)21 d細(xì)胞爬片，PBS沖洗后，加入4%中性甲醛，固定30 min;②染色，吸去固定液，加入0.1%的茜素紅染色液，染色6～10 min;③鑒定觀察，PBS洗2次，去除殘留的染色液，洗去未結(jié)合染料，甩干玻片后，甘油明膠封固，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.5 hBMSCs成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)與鑒定 待細(xì)胞爬片基本融合后，加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基［9］(含100 μg/L生長(zhǎng)分化因子5，10－7mol/L地塞米松、50 mg/L維生素 C、1%ITS+、40 mg/L L-脯氨酸、100 mg/L 丙酮酸鈉的自制無(wú)血清培養(yǎng)液)，每隔3 d換液，連續(xù)培養(yǎng)21 d。倒置顯微鏡下每天觀察hBMSCs生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。

阿利新藍(lán)及核固紅染色:①固定，取誘導(dǎo)21 d細(xì)胞爬片，PBS漂洗3 min，加入40 g/L多聚甲醛4℃固定30 min;②染色，吸去固定液，蒸餾水漂洗后加入1%阿利新藍(lán)冰醋酸溶液(pH 2.5)，室溫染色30 min，蒸餾水漂洗2 min，0.1%中性核固紅溶液染色5 min;③鑒定觀察，用蒸餾水沖洗后在顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 hBMSCs細(xì)胞表面抗原的鑒定

采用免疫熒光法對(duì)hBMSCs表面分子進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示:CD44、CD105呈陽(yáng)性，CD34呈陰性。連續(xù)傳代后hBMSCs表面分子表達(dá)無(wú)明顯改變。

2.2 hBMSCs成脂分化能力測(cè)定

加入成脂誘導(dǎo)液后，hBMSCs細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞呈圓形或多角形;1周后細(xì)胞核周?chē)行≈纬霈F(xiàn);2周后，胞內(nèi)小脂滴逐漸增多并融合成大脂滴，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多邊形;第3周，油紅 O染色顯示有大量脂質(zhì)沉淀。

2.3 hBMSCs成骨分化能力測(cè)定

更換成骨誘導(dǎo)液后，hBMSCs細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞呈多角形或不規(guī)則形;誘導(dǎo)1周后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒明顯增多;2周后，細(xì)胞聚集呈多層生長(zhǎng)，胞質(zhì)內(nèi)充滿(mǎn)顆粒，胞間可見(jiàn)鈣質(zhì)沉積;第3周，細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，茜素紅染色顯示紅色鈣結(jié)節(jié)。

2.4 hBMSCs成軟骨分化能力測(cè)定

加入軟骨誘導(dǎo)液后，hBMSCs細(xì)胞增殖明顯，1周后細(xì)胞呈多邊形或類(lèi)圓形;第2周細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞數(shù)量明顯增多;第3周細(xì)胞寬大扁平，呈多層生長(zhǎng)，局部可見(jiàn)細(xì)胞集聚成團(tuán)塊狀結(jié)晶，阿利新藍(lán)及核固紅染色陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈紫紅色。

3 討論

骨髓中除了造血干細(xì)胞外，還有一類(lèi)具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞群體，被稱(chēng)為間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。BMSCs是骨髓微環(huán)境中很重要的組份并發(fā)揮著重要作用。既往研究表明BMSCs具有支持造血和調(diào)控造血干細(xì)胞增殖和分化的能力。趙志華等研究證明多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中存在具有多向分化能力的BMSCs，其具有體外支持造血的功能［10］。

另有學(xué)者認(rèn)為可以通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)生物學(xué)特性，細(xì)胞表型和多向分化潛能等方面綜合推斷鑒定hBMSCs［11，12］。本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離 hBMSCs，自制無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的hBMSCs呈現(xiàn)典型的均一梭形旋窩狀貼壁生長(zhǎng)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。采用免疫熒光方法檢測(cè)hBMSCs細(xì)胞表型的表達(dá)，所分離的第4代細(xì)胞CD44、CD105呈陽(yáng)性，CD34呈陰性表達(dá)，也符合hBMSCs細(xì)胞表面抗原特征。為了進(jìn)一步鑒定hBMSCs的多向分化潛能，第4代細(xì)胞分別應(yīng)用成脂、成骨和成軟骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)hBMSCs，分別用油紅O染色、茜素紅染色、阿利新藍(lán)和核固紅染色，結(jié)果均呈陽(yáng)性，肯定了hBMSCs成脂肪、成骨、成軟骨分化的潛能。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本方法所分離培養(yǎng)的細(xì)胞，是實(shí)驗(yàn)所需要的hBMSCs，為后續(xù)進(jìn)行的體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

［1］Kortesidis A，Zannettino A，Isenmann S，et al.Stromal-derived factor-1 promotes the growth，survival，and development of human bone marrow stromal stem cells〔J〕.Blood，2005，105(10):3793.

［2］Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells〔J〕.Science，1999，284(5411):143.

［3］郭立達(dá)，王 捷，夏 冰，等.改良法培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006，22(2):131.

［4］Derfoul A，Perkins GL，Hall DJ，et al.Glucocorticoids promote chondrogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells by enhancing expression of cartilage extracellular matrix genes〔J〕.Stem Cells，2006，24(6):1487.

［5］都義日，付小兵，李存保，等.表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在體誘導(dǎo)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向皮膚組織分化作用的研究〔J〕.創(chuàng)傷外科雜志，2005，7(2):127.

［6］Deng J，Petersen BE，Steindler DA，et al.Mesenchymal stem cells spontaneously express neural proteins in culture and are neurogenic after transplantation〔J〕.Stem Cells，2006，24(4):1054.

［7］Backesjo CM，Li Y，Lindgren U，et al.Activation of Sirt1 decreases adipocyte formation during osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells〔J〕.J Bone Miner Res，2006，21(7):993.

［8］Wang QD，Lian HK，Wang CP，et al.Cultivation optimization and multi-directional differentiation potential of adult bone marrow mesenchymal stem cells〔J〕.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu，2010，14(49):9142.

［9］Bai X，Xiao Z，Pan Y，et al.Cartilage-derived morphogenetic protein-1 promotes the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2004，325(2):453.

［10］趙志華，趙智剛，陸 寧，等.多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2010，25(5):441.

［11］Rosova I，Dao M，Capoccia B，et al.Hypoxic preconditioning results in increased motility and improved therapeutic potential of human mesenchymal stem cells〔J〕.Stem Cells，2008，26(8):2173.

［12］Hung SC，Pochampally RR，Chen SC，et al.2009-02-22Angiogenic effects of human multipotent stromal cell conditioned medium activate the PI3K-Akt pathway in hypoxic endothelial cells to inhibit apoptosis，increase survival，and stimulate angiogenesis〔J〕.Stem Cells，2007，25(9):2363.