1株野生大型食用菌的分子鑒定與同源性分析

雷 瓊，汪 儉，范曉丹，章 俊，馬立安 （長江大學生命科學學院，湖北荊州434025）

世界食用菌資源非常豐富，目前有1500～2000種，其中已經確認的有981種［1］，大約還有1／2的尚未鑒定。傳統食用菌的分類及鑒定主要是基于菌絲、孢子和子實體的形態學特征并結合其生理生化性狀的描述，但由于真菌形態特征易受到培養條件和其他因素的影響，許多子實體類型經常難以獲得，因而傳統的分類方法已無法滿足一些未知品種的分類及鑒定要求。

真菌核糖體基因轉錄間隔區 （internal transcribed spacer，簡稱ITS），又叫內轉錄間隔區，是位于真菌核糖體DNA上18s和28s基因之間的區域片段，其兩側分別是18sRNA基因和28sRNA基因，其長度一般為650～750bp；White等［2－3］于1990設計了ITS1、ITS4、ITS53對引物可用于大多數擔子菌和子囊菌的特異性鑒定引物。張智毓等［4］應用ITS序列對草原珍稀食用菌蒙古口蘑與其相似的草原蘑菇種進行了真偽鑒定，PCR擴增分析結果有效鑒定出了蒙古口蘑，并分析出來自不同地區采集的蒙古口蘑親緣關系比較近。李晶等［1］采用形態學鑒定方法與現代分子生物學技術相結合將1種野生食用菌鑒定為金山巨菇 （Tricholoma sp．）。

因此，將傳統的形態學鑒定方法與現代分子生物學技術相結合，能更客觀、真實地反映物種間的差別，而且核糖體r DNA基因轉錄內部間隔區 （ITS）序列分析可以應用于屬下種間及亞種水平的鑒別，從而可以推斷出菌株的確切種類［5］。

1 材料與方法

1．1 供試樣品

供試樣品采集于2012年8月10日在英國諾里奇東安吉利亞大學校區草坪橡樹 （Quercus）上 （圖1）。將新鮮的子實體烘干后粉碎成粉末并過篩，儲存備用。

1．2 子實體形態觀察

取子實體完整部分，觀察并描述其表面性狀、結構、顏色、質地及切面，進行形態學特征初步鑒定。

1．3 DNA提取

稱取適量樣品粉末，放入研缽中加入液氮碾磨充分破碎細胞，將碾磨碎粉轉入離心管種中，樣品DNA的提取方法參照改進的CTAB法［6］進行。提取的總DNA經0．8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．4 PCR擴增ITS序列

圖1 生態照

ITS序列上游引物ITS 5：5’－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3’，下游引物ITS4 5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’［7］；擴增反應于Bio－Rad PCR儀上進行。PCR反應體積為25μl，其體系 為 2．5μl 10× Taq Buffer，2．5μl d NTPs （2mmol／L），0．5μl Taq （2U／μl），0．5μl 上 游 引 物（10μmol／L），0．5μl下游引物 （10μmol／L），16．5μl dd H2O，2μl DNA 模板 （100～300）ng／μl。PCR擴增程序為：94℃預變性4min；94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環；72℃延伸10min。擴增產物經1．5%瓊脂糖凝膠電泳，產物和Mark上樣量均為5μl，電泳結果于Bio－Rad凝膠成像系統成像。

1．5 ITS片段純化、測序

根據PCR電泳的結果，目的條帶單一特異的PCR產物經Axy Prep PCR清潔試劑盒純化；有非特異性雜條帶的PCR產物經電泳、切膠，收集目的片段，凝膠回收試劑盒回收純化；純化后的PCR產物送生工生物 （上海）股份有限公司測序。

1．6 ITS序列比對和同源性分析

將測序獲得的序列通過NCBI進行Blast，分析同源性。當物種的r DNA ITS區序列與比對的序列同源性達≥99%，可認為相同種；同源性在95%～99%為相同屬；同源性≤95%為相同科［5］。進一步分析相同種或屬的分布范圍、宿主及比較內轉錄間隔區1（internal space1 ITS1）；內轉錄間隔區2（internal space 2）；18S r DNA基因序列，5．8S編碼序列，28S r DNA基因序列等信息。

2 結果與分析

2．1 樣品子實體形態特征

樣品子實體大型肥厚，肉質多汁，復瓦狀疊生，基部愈合呈狹細的柄狀，側生，從基部分出若干個大小不相等的扇形或半圓形菌蓋，左右數個相連，常十幾層重疊在一起 （圖2）。幼時顏色鮮艷，表面橙黃至桔紅色，有細絨和皺紋，像雞冠；菌肉白色或淺黃色；后期色漸退，干燥后呈干酪狀、硬而脆等形態特征。

圖2 子實體形態

2．2 ITS序列擴增

采用CTAB法提取樣品子實體基因組DNA，ITS5和ITS4引物進行體外PCR擴增，ITS序列PCR產物凝膠電泳如圖3。PCR產物條帶清晰單一，片段大小大于600bp以上，與理論值相符。將產物采用PCR試劑盒純化后送生工生物 （上海）股份有限公司測序。

2．3 ITS PCR產物測序分析

樣品經上海生物生工股份公司測序，結果如圖4。ITS序列長度為609bp，5．8S片段為159bp（圖4方框部分）；G＋C含量為50．9%。

2．4 ITS序列比對

圖3 樣品ITS序列PCR擴增電泳

圖4 樣品測序ITS堿基序列

將樣品ITS序列在NCBI上進行比對 （Blast）分析，結果如圖5。樣品與硫磺菌 （Laetiporus sulphureus，登陸號EU840609．1）的DNA序列同源性為100%。結合傳統的形態特征鑒定結果，鑒定該樣品屬擔子菌亞綱非褶菌目或多孔菌目、多孔菌科、硫磺菌屬，暫命名為硫磺菌種－UK菌株。同時將樣品序列提交Genbank，獲得登錄號為KF897014。

2．5 ITS序列同源性分析

對樣品ITS序列同源性進行進一步分析，結果如表1。與樣品ITS序列同源性為100%的有2個，登錄號分別為EU840609．1和EU840614．1，均來源于瑞典，生長宿主分別是柳樹 （Salix babylonica）和栓皮櫟 （Quercus variabilis）；同源性為99%的有30個 （表1列出部分），分別來自美國、德國、加拿大、瑞典、丹麥、立陶宛、捷克共和國、烏拉圭和波蘭等國家，沒有發現英國的報道；宿主來自黑柳（Salix Atrocinrea Brot）、白柳 （Salix alba）、櫟樹 （Quercus）、栓皮櫟 （Quercus variabilis）、桉樹（Eucalyptus spp．）、白蠟樹 （Fraxinus）和酸櫻桃 （Prunus cerasus）等多種樹木。

內轉錄間隔區1（ITS 1）一般在161bp左右；5．8S編碼序列一般在159bp左右；內轉錄間隔區2（ITS2）一般在200bp左右；18S和28S基因序列變化幅度較大。ITS序列一般在500～600bp左右。可見硫磺菌物種的5．8S具有高度保守性，ITS1、ITS2序列中度保守性，與陳劍山等［2］報道結果相一致。

圖5 樣品與硫磺菌 （登錄號EU840609．1）ITS序列比對

表1 樣品與同源性100%～99%的硫磺菌ITS序列分析

3 討論

傳統的形態學特征分類法具有易于觀察和比較的優勢，因其由多基因同時決定，具有相對的穩定性。但傳統形態學分類方法也存在不足之處，由于外界的環境條件、表型的可塑性和基因變異等原因，尤其是地域分隔的原因，造成了食用菌種內的形態多樣性較高的現象，對種和親緣種的鑒定存在分歧，因此，引入分子生物學技術作為它們的重要補充，便能提供更多有效的分類信息。現代分類學研究的趨勢將以形態學研究為基礎，結合分子生物學技術、生物化學、生態學等方法進行綜合分類研究，使其在解釋系統發育、生物進化和生物親緣關系上可以獲取更多信息，其研究結果更趨于自然。

本研究將傳統的形態學鑒定方法與現代分子生物學技術相結合，鑒定該樣品為硫磺菌 （Laetiporus sulphureus），ITS序列同源性分析，發現同源性非常高，其中2個同源性為100%，30個為99%，還有同源98%等等；廣泛分布于美國、德國、加拿大、瑞典、丹麥、立陶宛、捷克共和國、烏拉圭和波蘭等10多國；宿主范圍也廣，生長在黑柳、白柳、櫟樹、栓皮櫟楊梅、栓皮櫟、桉樹、白蠟樹和酸櫻桃等多種樹木上。在同源性99%～100%的32個硫磺菌中，沒有發現來自英國的報道。英國諾里奇地區氣候溫和，天氣變化頻繁，全年雨水豐富，有著豐富的野生菌類資源。因此，本研究是對食用菌—硫磺菌物種資源的分布和宿主范圍研究的進一步豐富。

［1］李 晶，林冬梅，林占熺，等．一種野生食用菌的分子及形態學鑒定 ［J］．現代農業科技，2012，（8）：110－111，115．

［2］陳劍山，鄭服叢．ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應用 ［J］．安徽農業科學，2007，35（12）：3785－3786，3792．

［3］白樹猛，田 黎．ITS序列分析在真菌分類鑒定和分子檢測中的應用 ［J］．畜牧與飼料科學，2009，30（1）：52－53．

［4］張智毓，姚慶智，閆 偉．草原珍稀食用菌蒙古口蘑菌種的分子鑒定 ［J］．生物技術，2011，21（3）：40－43．

［5］Landeweert R，Leeflang P，Kuyper T W，et al．Molecular identification of ectomycor rhizal my celium in soil horizons［J］．Appl Environ Microbiol，2003，69：327－333．

［6］臧金平，連 賓，袁 生．簡便易行的食用菌菌絲體基因組DNA提取法 ［J］．食品科學，2005，26（3）：66－68．

［7］賈定洪，郭 勇，鄭林用，等．野生香蘑屬菌株的ITS序列分析 ［J］．食用菌，2010，（1）：21－23．