高通量測序技術在黃連解毒湯抗白念珠菌機制研究中的應用及探討

曹毅 翁鶴 楊曉紅

白念珠菌(Candida albicans)又稱白假絲酵母菌，廣泛存在自然中，是人類和動物共患的深部條件性致病菌，寄居于皮膚、口腔、胃腸道等部位，通常情況下并不引起發病。而在菌群失調或宿主免疫力低下時大量繁殖，轉為致病形態，形成病灶，引起皮膚、粘膜及內臟的念珠菌病，嚴重的深部白念珠菌感染可危及病人的生命［1-2］。據統計，深部白念珠菌感染病死率高達68．9%。目前，隨著艾滋病的傳播，癌癥放化療的開展、器官移植后免疫抑制劑的應用，以及導管等越來越多生物材料的應用，白念珠菌感染率不斷增加，并發生反復感染，已經成為醫學上備受關注的問題［3-4］。臨床上主要以三唑類藥物進行治療和預防［5］，該類藥物的作用方式為抑菌作用，因此療程長，在長期使用過程中逐漸使耐藥真菌比例增多或出現耐藥突變。在有限的藥物資源條件下，醫藥工作者試圖通過個體化用藥、聯合用藥和應用免疫調節劑等策略克服白念珠菌耐藥問題，其中，探索科學的聯合用藥方案、開發新的抗真菌藥物和抗菌增效劑是公認的最有效的策略。

大量中藥被證實具有明確的抗真菌作用，且副作用小、來源廣、價格低廉和較少出現耐藥。因此，研究開發抗真菌中藥具有良好前景［6-7］。筆者所在的課題組發現中藥黃連解毒湯不僅具備良好的抗真菌活性(須癬毛癬菌和白念珠菌的平均最小抑菌濃度值分別為0．0034 g/ml 和0．017 g/ml)，同時該藥與西藥聯合應用時表現出良好的協同作用，可明顯提高西藥的抗真菌作用，增加真菌對藥物的敏感性，具有良好的增效作用［7］。但是目前對其本質的認識尚存在空白，因而制約了其發展，同時也潛在著廣闊的研究內容，目前在國家自然科學基金的支持下，課題組已啟動建立了與高通量活性篩選相結合的黃連解毒湯抗白念珠菌生物學機制的分析研究體系，以下將介紹有關基本情況。

1 三唑類抗真菌藥物抗白念珠菌的機制及耐藥情況

目前，臨床上廣泛應用的抗真菌藥物為三唑類(如酮康唑、氟康唑、伊曲康唑等)、兩性霉素B 和5-氟胞嘧啶［5］。5-氟胞嘧啶能引起胃腸道反應、一過性轉氨酶升高、堿性磷酸酶升高及白細胞和血小板減少等不良反應，同時能快速產生5-氟胞嘧啶耐藥菌株，因此該藥很少用于臨床治療深部真菌感染;兩性霉素B 無論口服還是肌肉注射均難吸收，大部分藥劑在體內代謝滅活，不易透過血腦屏障，并且在體內消除緩慢，引起較多不良反應，最常見包括靜滴藥物后寒戰、高熱等即刻反應以及貧血、肝腎毒性、低血鉀等。且該藥腎毒性大，并呈劑量依賴性，約80%患者發生氮質血癥，這些因素大大限制了該藥在臨床上作為常規藥物的應用。三唑類抗真菌藥物是目前使用最廣泛的一類抗真菌藥物，其中，酮康唑是最先使用的口服藥，而現在多被更有效低毒的三唑類衍生物如氟康唑和伊曲康唑等取代。氟康唑為廣譜抗真菌藥，其抗菌譜與酮康唑相似，體內抗真菌作用比酮康唑強10 ～20 倍。除對氟康唑具有天然耐藥性的克柔氏念珠菌和光滑念珠菌外，氟康唑對其他念珠菌、隱球菌、毛孢子菌屬、毛癬菌屬、皮炎芽生菌及粗球孢子菌等均比較敏感。因其吸收好、給藥方便、抗菌譜廣、療效高和毒副作用小等特點，是目前臨床上治療白念珠菌感染的首選藥物，得到廣泛應用［8］。伊曲康唑能優先與角蛋白組織(如指甲、頭發和皮膚)結合，因此在治療淺表、皮下真菌感染方面有良好的療效。該藥對非白念珠菌和曲霉菌屬的真菌有廣譜抗菌活性。然而其口服吸收差，在臨床深部真菌感染治療效果受限制，因此該藥主要作為侵襲性曲霉菌病的二線用藥及組織胞漿菌病和皮炎芽生菌病的一線用藥。

由于目前日益嚴重的耐藥現象和有限的治療藥物使白念珠菌感染成為臨床上迫切需要解決的問題。因此，深入研究真菌的生化反應機制和耐藥機理已經成為必要。研究人員發現，臨床產生耐藥的原因主要包括細胞間藥物量積累的減少、藥物對靶標蛋白結合力降低、靶標表達水平增高以及麥角甾醇合成途徑的改變等［9-10］。Dunkel 等［11-13］發現編碼轉運蛋白包括ATP 結合盒式蛋白(ATP-bindingcassette transporter，ABC)的CDR1 和CDR2 基因，及編碼易化擴散載體超家族(major facilitator superfamily，MFS)蛋白的MDR1 基因等過量表達，引起大量藥物快速排除真菌細胞，使細胞間藥量積累水平明顯降低，這是造成真菌耐藥的重要原因之一。Clemens 等進一步研究發現，轉運蛋白的過量表達是由于其轉錄調控因子發生點突變引起的，因此，轉錄調控因子點突變是致使真菌產生耐藥性的深層次原因。目前，已發現的轉錄調控因子點突變包括A643T、G648D 等［14-15］。Lamb 等發現三唑類藥物靶標蛋白ERG11 點突變后，蛋白構象發生變化，使藥物對靶標蛋白的結合力降低，造成真菌耐藥［16］。目前，已發現的點突變包括F126L、G129A、Y132H、T229A、G307S、S405F、F449S、G464S、G465S、R467K、I471T 等［10，17-18］。ERG11 表達量增高是真菌耐藥的另一個重要原因。Marichal 等［19］發現C．glabrat 耐藥菌株中ERG11 基因存在多個拷貝，Heilmann 等發現轉錄調控因子UPC2p 點突變能調控ERG11 表達量增加，引起耐藥現象［12］。此外，Chau等［16-20］研究發現ERG3 突變造成功能缺失，引起麥角甾醇合成途徑的改變，也能引起真菌耐藥。分子流行學研究發現多個耐藥機制可同時存在于一個耐藥菌株中。Wirsching 等［15］證實一個白念真菌菌株的耐藥是由于MDR1 基因表達上調和ERG11 蛋白G463S 點突變共同造成的。

2 中藥黃連解毒湯在抗白念珠菌方面的研究前景分析

中醫學中有大量中藥被證實具有明確的抗真菌作用，且中藥具有副作用小、來源廣、價格低廉和較少出現耐藥等優點，因此，研究開發抗真菌中藥具備良好前景［6-7］。中藥具有很多活性強而副作用小的有效成分，許多化合物結構新穎，與現有藥物完全不同，因此從中藥中尋找抗真菌新藥或先導化合物，是近年中藥研究的熱點之一。目前已經研究發現的具有抗真菌作用的中藥及其單體主要包括粉防己［21］、吳茱萸［22］、黃芩苷［23-24］等。黃杉等［23］發現聯用黃芩苷和氟康唑可以有效抑制氟康唑耐藥的白念珠菌株生長，目前一般認為黃芩苷對白念珠菌生物膜形成有抑制作用［24］。

黃連解毒湯，首載于葛洪《肘后備急方》，是中醫藥中已發現的具有良好抗菌作用的藥劑之一，由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成，具有清熱、瀉火、解毒之功效，主治一切實熱火毒、三焦熱盛之證?，F代藥理學研究認為黃連解毒湯具有良好的抗菌作用，除對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型鏈球菌、變形桿菌、痢疾桿菌和大便產堿桿菌等多種細菌有明顯抑制作用外，對白念珠菌懸浮菌亦具有良好的抑制作用，其最小抑菌濃度范圍為0．0016 ～0．0063 g/ml［19］。此外，臨床應用黃連解毒湯浸泡治療足癬也取得良好的治療效果，總有效率高達82．5%。因此，從表型實驗及臨床數據顯示，黃連解毒湯有良好的抑菌效果，并極大增強西藥殺菌作用。但基本未涉及分子機理的研究，比如:白念珠菌受黃連解毒湯處理時，響應的關鍵基因是什么，以及其信號傳遞網絡等。由于幾乎沒有其他可參考的數據，因此，構筑數據平臺、提供參考線索，是挖掘黃連解毒湯對白念珠菌作用機制的先決條件，而采用新一代高通量測序技術測定轉錄組的變化是一個快速有效的解決方案。充分利用現代科學技術和方法進行高效快速的黃連解毒湯抗白念珠菌的藥效和作用機理的研究，不但是挖掘、發展和完善中醫藥寶庫的迫切需要，而且是中藥現代化研究中急需解決的根本問題。

3 高通量測序技術在藥物研究中的應用

3．1 基因測序技術發展

基因測序技術的發展大體上可分為三代，第一代為毛細管電泳測序技術，第二代為高通量測序技術，第三代為單分子測序技術。目前，國外憑借其高通量基因測序技術和測序設備的研發優勢，利用基因資源的唯一性，搶先申請基因專利，謀求壟斷未來全球的基因產業。而高通量基因測序技術的研究在中國目前處于起步階段，具有非常重要的迫切性。在未來，生物醫藥、臨床醫療等領域的開展都將建立在現代的基因測序技術基礎上，尤其在基因診斷和基因治療方面。

3．2 毛細管電泳測序技術

在1977 年，Sanger 等提出了經典的雙脫氧核苷酸末端終止測序法，在Sanger 法的基礎上，1986 年美國應用生物系統公司(ABI)推出世界上第一臺全自動電泳測序儀，以熒光標記代替放射性同位素標記、以熒光信號接收器和計算機信號分析系統代替放射性自顯影的自動測序儀，也把該研究成果發表在雜志《Nature》上。毛細管電泳測序技術使得人類獲取全基因組圖譜的夢想得以實現，1990 年美國國會正式批準了人類基因組計劃(1990 年)。人類基因組計劃耗時13 年，耗資約30 億美元，完成了由30 億個堿基對組成的人類基因組DNA 關鍵序列圖的測序工作，中國于1999 年9 月加入國際人類基因組計劃，承擔該次人類基因組計劃1%工作，用6 個多月的時間完成了人類第3 號染色體短臂從D3S3610 至端粒的30 Mb 區域上3000 萬個堿基對的測序任務。目前國內從事毛細管電泳測序技術的有關院校和單位有中國科學院、中國科技大學與臺灣國立成功大學、國立中山大學、浙江大學、福建師范大學、中山大學等。

3．3 高通量測序技術

雖然毛細管電泳測序技術已經幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但是存在成本高、速度慢等方面的不足。高通量基因測序技術是對毛細管電泳測序技術一次革命性的改變，該技術的特點是可以對大量DNA或RNA 直接測序，并通過測序結果和標準基因組序列(本物種或其他相近)的分析比對，在轉錄水平上確認基因的表達量，即獲得精確的數字表達譜及具體響應基因。第一個推向市場的高通量基因測序儀是2005 年10 月由美國的454 Life Sciences 公司推出的GS20。高通量測序設備具有極高的測序通量，相對于第一代的96 道毛細管電泳測序儀，高通量測序一次實驗可以讀取相當于40 萬到400 萬條通道的序列。讀取長度根據各個公司的高通量基因測序儀不同，從25 bp 到450 bp，不同的測序儀在一次實驗中，可以讀取1 G 到14 G 不等的堿基數。高通量測序技術的強大快速測序能力使得對一個物種的RNA 轉錄組、全基因組進行功能分析等成為可能。自2007 年1 月Illumina 公司新一代高通量測序儀Solexa 正式商業化使用以來，國際權威期刊《Nature》和《Science》已有多篇論著報道新一代高通量測序儀成功測定物種的基因及轉錄組。Liu等［25］應用高通量測序技術分析三唑類藥物戊唑醇處理后禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)基因表達量的變化，發現麥角甾醇生物合成途徑中的多個基因表達量明顯上升，極大地響應了藥劑的處理。中國第一臺高通量測序儀是深圳華因康基因科技有限公司在2008 年10 月推出，第二代高通量測序儀的測序能力在不斷得到提高，而測序費用在不斷的降低。2007 年，美國國立人類基因組研究會提出利用第二代高通量測序技術，測序個人基因組只需花費1000 美元的目標。

3．4 單分子測序技術

單分子測序技術作為未來的第三代測序技術，它將是分子影像技術、納米技術等多項技術的結晶。分子影像技術可以在細胞、基因和分子水平上實現生物體內部生理或病理過程的無創實時動態在體成像，而納米技術應用于分子影像學的根本目的就是為增強熒光分子探針識別特異性靶分子的能力，提高分子顯像效果，實現微觀機理的可視化，但是目前單分子測序技術尚未商業化。

4 高通量測序技術在黃連解毒湯對白念珠菌作用機制方面的應用前景

由于使用高通量測序技術可以實現對不同組織mRNA 表達差異進行檢測，通過與基因組進行比較可以確定組織特異表達的基因，因此具有取代“基因芯片”技術的態勢。由于基因芯片的檢測范圍取決于芯片上探針的信息，因此只能檢測人們已知序列的特征，缺乏發現尋找新，基因的能力，而高通量測序則能夠很好地彌補基因芯片這方面的不足，因此在未來的幾年中，高通量測序技術將會取代“基因芯片”越來越成熟并得到更加廣泛的應用。

因此認為可以以新一代高通量測序技術的發展為契機，應用該技術測定黃連解毒湯處理白念珠菌過程中菌株轉錄組的變化，采用生物信息學方法對測序結果進行分析、整理和歸類，識別其中的響應基因及網絡。同時，結合特異性熒光定量PCR 法的大樣本驗證工作及基因敲除等研究手段，觀察敲除關鍵基因后的突變白念珠菌對黃連解毒湯敏感性、致病性、生長特性和抗逆性等表型的改變，詳細鑒定關鍵基因功能。另外，利用臨床分離到的黃連解毒湯白念珠菌抗性和敏感菌株，測定關鍵基因序列，并采用真菌轉化技術，觀察含有點突變的關鍵基因轉化子對黃連解毒湯抗性的變化，以期明確黃連解毒湯對白念珠菌的作用機理及調控網絡，從理論上闡明黃連解毒湯對西藥的增效作用。有助于真菌臨床耐藥問題監測工作的開展，并為新藥物開發和新型治療方案研制提供理論依據，同時為古方的現代化應用提供新的研究思路，必將產生較大的社會效益及經濟效益。

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