發酵對中藥減毒增效的研究進展

楊光明 ， 涂 霞 ， 潘 揚 *，

（1.南京中醫藥大學 國家中醫藥管理局中藥炮制標準重點研究室，江蘇 南京，210023；2.南京中醫藥大學 藥用菌與中藥生物技術研究所，江蘇 南京，210029）

中藥有毒自古有之，《神農本草經》把中藥分為上、中、下三品，指出下品“多毒，不可久服”；明代李時珍在《本草綱目》中列有毒草專列，僅此記載就有47種毒性藥；《中華人民共和國藥典》2010年版收載毒性中藥82個，其中大毒品種10個，有毒品種41個，小毒品種31個。中藥的毒性，在中醫古籍中即中藥的偏性。它與四氣五味、升降浮沉等都屬于中藥性能的范疇。長期的中醫藥臨床實踐證明，毒性中藥對于疾病的防治具有十分積極的意義，尤其在救治疑難重癥方面每起沉疴，素有“以毒攻毒”之說。但有毒中藥的毒性常常限制了其臨床應用。有毒中藥通常要經過特殊的方法加工，如加熱、水處理、加輔料、制霜等，傳統上稱為“炮制”，以達到減毒增效的目的。

隨著生物科技的發展，國內外逐步重視對現代發酵應用于中藥的研究開發，并已取得了很大進展[1-4]。中藥發酵根據其發展歷史分為傳統發酵與現代發酵。傳統發酵是發酵工業中一項古老的工藝。目前所指的中藥發酵基本上是現代發酵技術，其關鍵條件是純種大規模集約化培養，發酵炮制是建立在傳統炮制方法基礎上的現代發酵技術，具有保護中藥活性中心免遭破壞以及對中藥毒性成分進行結構修飾以產生新成分的優勢。發酵為毒性中藥產生新藥效，擴大適應癥提供了一個嶄新的途徑，用發酵炮制中藥使中藥減毒增效的研究也越來越多。作者在大量文獻調研的基礎上，從動物、植物、礦物藥三個方面分別詳細綜述了發酵炮制在中藥減毒增效方面的應用和發展。

1 發酵炮制在毒性中藥減毒增效中的應用

我國早在北魏時期就已應用微生物發酵炮制中藥，實現了增強中藥藥效、改變藥性的目的。傳統中藥的發酵炮制品有神曲、建神曲、半夏曲、沉香曲、采云曲、紅曲、淡豆豉、百藥煎、片仔癀等，在長期臨床應用中均未出現毒性反應事件。現代藥理毒理實驗也證明中藥發酵制劑的安全性。如韓春楊等[5]采用由黃芪、黨參、茯苓、甘草、神曲、麥芽和山楂組成的復方發酵制劑經過實驗認定該制劑在短期內使用安全，毒性級別應屬于“實際無毒級”，是一種比較安全的制劑。蔣保季等[6-7]對人工發酵培育冬蟲夏草進行毒性研究，人工發酵培育的冬蟲夏草急性毒性和亞慢性毒性均未見異常，對實驗動物體細胞、生殖細胞以及細菌均未見致突變作用，無遺傳毒性，證明該物質毒理學上是安全的。王衛倩等[8]首次應用雙向性固體發酵技術將雷公藤進行減毒，并將不同發酵時間的靈雷菌質進行急性毒性實驗，充分表明雙向性固體發酵技術是降低雷公藤毒性的有效途徑。莊毅[9]研究的槐耳菌質所提的清膏經過動物急性毒性試驗、長期毒性試驗、特殊毒理試驗等，表明槐耳菌質的安全性。槐耳菌質及其沖劑對中晚期原發性肝癌有效，早已被批準為中藥一類新藥正式投產。急性毒性試驗能證明發酵方法對中藥解毒的可行性，但有毒中藥經過發酵以后進行毒性比較的報道較少，值得重視。

1.1 發酵在毒性植物類中藥中的應用

越來越多的研究報道發酵應用于炮制毒性植物藥以實現減毒增效的目的。大黃中結合型蒽醌是瀉下的主要成分，在很多情況下也可能引起副作用，而游離型蒽醌為抗菌、抗腫瘤等的主要有效成分，瀉下作用極弱。戴萬生、趙榮華[6]將發酵法應用于大黃炮制，大黃經釀酒酵母、面包酵母37℃分別發酵16 d后，其總蒽醌含量僅略有降低，與傳統炮制方法比較，保存了更多的大黃總蒽醌，其中起到瀉下作用的結合型蒽醌含量降低至生品的一半左右，而作為抗菌、抗腫瘤的主要成分的游離型蒽醌含量增加了6倍左右。說明發酵法能使大黃結合型蒽醌轉化為游離型蒽醌，從而緩和大黃峻烈的瀉下作用及對胃腸道的不良反應。還發現大黃發酵后可能被分解為蒽醌甙元。

五倍子含有五倍子鞣質、沒食子酸等。有收斂止瀉、止血作用，是一種常見的對肝臟有毒副作用的含鞣質類中藥，具有斂肺降火、澀腸止瀉、固精縮尿、止汗、止血的作用，其活性機理主要是由于它所含的鞣酸與細胞中的蛋白質結合成不溶于水的沉淀物，從而抑制了細胞分泌，促進水液的再吸收而發揮收斂作用。但鞣酸在腸道內會遇食物中的蛋白質，并與之結合，因而降低了它的作用。為了克服這一缺點，鄭利華等[11]根據臨床酶學的有關理論，采用含有根霉菌的酵曲發酵五倍子，曲中還含有L-賴氨酸等物質。利用根霉菌能促進L-賴氨酸生成的作用形成更多的L-賴氨酸。L-賴氨酸能促進胃腸道粘膜吸收食物中的蛋白質，有效地減少大分子沉淀物的形成與對胃黏膜的刺激，因此能有效地避免鞣酸在胃腸道內競爭性消耗，從而提高了五倍子的收斂作用，并降低或消除了部分患者服用后食欲不振的副反應。瞿燕[12]測定了五倍子生品、發酵品和水解產物中五倍子鞣質和沒食子酸的含量并進行了抗炎、抗菌、止咳、祛痰藥理實驗的對比。結果表明：發酵品和水解產物中沒食子酸的含量高，抗菌和祛痰作用強于生品。

馬錢子是一味中醫傳統使用的“有毒中藥”。成人用5～10 mg即可發生中毒現象，30 mg可致死亡。馬錢子有散結消腫、通絡止痛的功效，常借其“毒藥猛劑善起沉疴”，而用于風濕頑痹、麻木癱瘓、跌打損傷、疽癰腫痛等病證。現代研究證實，馬錢子所含生物堿中士的寧（番木鱉堿）與馬錢子堿（布魯生）為其主要有效成分及毒性成分，含量各約為1～1.4%。馬錢于堿藥效只有士的寧的1／40，而毒性則有士的寧的1／20[13]。為了降低馬錢子的毒性，臨床上常采用砂燙、油炸、爆壓法、甘草制、醋泡、醋炙、尿泡等，或同甘草、綠豆加水共煮等方法減毒。潘揚等[14]在莊毅[15]“雙向固體發酵技術”基礎上將馬錢子（藥材生品）與靈芝、槐耳、猴頭等20種真菌共同培養，產生馬錢子“藥性菌質”。發現雙向發酵后菌絲體生長良好的“藥性菌質”中馬錢子類生物堿成分發生了質和量的明顯變化，士的寧、馬錢子堿的含量均呈下降的趨勢，與生品相比分別下降60%、30%左右。而士的寧氮氧化物、馬錢子堿氮氧化物有不同程度的增加，且指紋譜中顯示出5個新產生的或含量變化較大的未知成分，在對紅栓菌發酵后的馬錢子菌質的急性毒性研究中，發現紅栓菌質的毒性已顯著下降，一次性灌胃給藥小鼠比未發酵者的LD50數值增加了16.6%。同時也觀察了[16]另外6種不同真菌——裂褶菌、竹黃、單色云芝、雞油菌、白僵菌和蟬花對馬錢子毒性和鎮痛、抗炎作用的影響。以半數致死量（LD50）為指標，測定馬錢子生品和炮制品及6種不同發酵品經灌胃給藥對小鼠的急性毒性；以雙氯芬酸鈉和生品為陽性對照，觀察6種不同發酵品對腹腔注射醋酸所致小鼠扭體反應的抑制（鎮痛）作用以及對外涂巴豆油所致鼠耳殼腫脹的減輕（抗炎）作用。結果表明，馬錢子通過6種真菌發酵后毒性降低，與炮制品基本一致；且它保持了馬錢子原有的鎮痛和抗炎作用，提示發酵可以為馬錢子的降毒保效提供一條新途徑。 潘揚等[17]還采用溶劑提取、硅膠柱色譜等方法對馬錢子發酵品的生物堿成分進行分離純化，根據化合物的理化常數和波譜數據鑒定其結構。結果從馬錢子發酵品中共分離得到10個生物堿成分，分別鑒定為士的寧（1）、馬錢子堿（2）、偽士的寧（3）、16-甲氧基士的寧（4）、番木鱉次堿（5）、士的寧氮氧化物（6）、馬錢子堿氮氧化物（7）、士的寧氯甲氯化物（8）、馬錢子堿氯甲氯化物（9）和喜樹次堿（10）。提示馬錢子發酵品的大部分化學成分仍然是吲哚類生物堿，其中僅有10是單萜吡啶生物堿，為首次從該種植物中分離得到；化合物4是首次從該植物的種子中分離得到；化合物8和9可能為氯仿提取過程中產生的人工加合物。迄今未見朱紅栓菌中含有上述生物堿的報道。與生品相比，馬錢子發酵品中生物堿成分發生了一定的變化，其中化合物4、6、7和10可能為發酵品新增成分，這些生物堿成分的鑒定為馬錢子發酵“去毒存效”原理提供了理論依據。

雷公藤為植物衛矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook的根，含雷公藤堿、雷公藤定堿等多種生物堿、二萜內酯、雷藤酮及衛矛醇等，清代趙學敏在《本草綱目拾遺》已詳細記載了其毒性：“采之毒魚，凡蚌螺亦死，其性最烈，以其草煙獯蠶子則不生”。有人誤服其葉2～3片可中毒，服嫩芽7個或根皮30 g以上可以引起死亡，甚至食其花蜜也可發生中毒。雷公藤能祛風除濕，活血通絡，消腫止痛，殺蟲解毒。雷公藤甲素抗腫瘤活性明顯強于紫杉醇，對卵巢癌和胃癌細胞等作用尤其明顯。王衛倩等[9]運用雙向性固體發酵技術得到靈雷菌質，并對其進行急性毒性實驗。發酵30 d的靈雷菌質急性毒性最低，這充分表明雙向性固體發酵技術是降低雷公藤毒性的有效途徑，同時還對靈雷菌質的藥效進行了研究，發現靈雷菌質仍保持一定的免疫抑制作用。寧黎麗[18]利用微生物轉化技術對雷公藤甲素進行生物轉化，使用篩選出的短刺小克銀漢霉對雷公藤甲素1a進行生物轉化，得到四個新的轉化產物，利用黑曲霉對雷公藤內酯酮2a進行生物轉化，得到一個轉化后的新產物，體外細胞毒活性實驗結果表明對五個腫瘤細胞株具有一定的細胞毒活性。張普照等[19]以雷公藤（帶皮的根）經藥用真菌G發酵后的藥性菌質為研究對象，采用兩種檢測手段探討解毒持效發酵過程中化學成分的動態變化規律。雷公藤經藥用真菌發酵后，改變了原藥材的化學成分組成。結合毒理藥效實驗結果，發現藥性菌質具有免疫抑制活性但比原藥材急性毒性低，因此證明該方法在雷公藤解毒持效中的可行性。在藥用真菌代謝中某些酶的催化下，雷公藤甲素的某個化學鍵斷裂或者和別的化合物發生反應且反應速度快，因此雷公藤藥材經藥用真菌發酵后甲素含量急劇下降。

苦參為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根，含有苦參堿和氧化苦參堿。苦參的根和種子都有毒。苦參堿具有抗癌活性，氧化苦參堿可防止小鼠因MMC、環磷酰胺所致小鼠白細胞減少癥。李雁群等[20]將苦參水煎汁接種靈芝發酵，采用細胞抑制試驗初步評價了苦參水煎汁靈芝發酵液的藥效學價值。作者觀察到苦參的靈芝發酵液能減少細胞培養液上清中HBsAg和HBeAg的含量，這個結果顯示苦參靈芝發酵液可能具有抗HBV的作用。試驗還表明，苦參經過靈芝發酵以后，沒有明顯改變其抗HBV的藥效作用，相反還降低了毒性。

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thumb.的干燥塊根，其藤莖稱 “夜交藤”。結合型蒽醌是何首烏致瀉和肝毒性的主要成分。現代醫學證實，何首烏中的蒽醌類物質，具有降低膽固醇、降血糖、抗病毒、強心、促進胃腸蠕動等作用，還有促進纖維蛋白溶解活性作用，對心腦血管疾病有一定的防治作用；動物實驗證明，何首烏還有抗腫瘤作用。杜晨暉等[21]對不同菌株發酵的何首烏樣品及其發酵前后的化學成分進行比較分析，并篩選出可以專一性降解何首烏中蒽醌類成分而不破壞其有效成分二苯乙烯苷的菌種。為降低何首烏的毒副作用，建立了一種炮制何首烏的新方法。

三七具有散瘀止血，消腫定痛之功效。三七總皂苷肌內注射450 mg/kg對大鼠具有明顯的肝臟、腎臟毒性[22]。李國紅等[23]聯合采用枯草芽孢桿菌對三七根進行發酵后，在對其中的皂苷成分的研究中發現，從發酵后的三七中分離到了人參皂苷Rh4，這種化合物未在發酵前檢測到，說明這種化合物是通過發酵產生的，可能是在發酵的過程中，三七須根的某些皂苷被微生物轉化為人參皂苷Rh4。馬偉光等[24]采用曲霉菌、根霉、毛霉和酵母菌為主要的發酵菌種，對粉碎的滇產三七根莖進行了固態生物轉化實驗，認為發酵法是發現和創新三七藥理活性的重要途徑。

喜樹堿和10-羥基喜樹堿是從珙桐科落葉喬木喜樹果實中提取的，喜樹堿具有較強的抗腫瘤活性，但同時又具有嚴重的胃腸毒性，如抑制骨髓功能和引起出血性膀胱炎等，制約了它的進一步應用，10-羥基喜樹堿目前除應用于消化道腫瘤、肺癌、生殖系統腫瘤外，還對白血病等其他腫瘤也有良好的治療作用，活性高且毒性低，是極富前景的抗癌藥物。但它在喜樹中的含量僅為十萬分之二，提取分離費時、費力，朱關平[25]采用無毒黃曲霉菌株1100T-419將喜樹堿轉化為10-羥基喜樹堿，轉化率達50%以上。其中就是運用微生物發酵技術將喜樹堿轉化為10-羥基喜樹堿，但是迄今為止尚未對喜樹的各用藥部位，尤其是抗癌活性很強的果實進行過液體或固體生物發酵研究，相信開展這方面的工作可能會有除10-羥基喜樹堿含量增高之外的新發現。

長春花有涼血降壓，鎮靜安神功效，長春堿的主要毒性為抑制骨髓功能；長春新堿對神經系統、胃腸道的毒性較突出。從長春花不同部位分離出100多種生物堿，但這些生物堿在植物體內含量低，且植物生長緩慢，資源短缺，限制了抗癌藥物的進一步開發。人們又轉而進行植物組培研究，但植物組培成本高，生產難度大，有效成分含量低，也未能成功應用于生產。由于植物真菌對植物某些藥效成分的形成有重要影響，甚至會產生和其寄主相同或相似的生理活性。楊顯志等[26]從長春花葉中分離出一株無孢菌群菌株97CY3，從該菌的發酵液中發現了長春新堿化合物，經HPLC分析其質量濃度達到0.205 g/L。張玲琪等[23]首次報道從長春花Catharanthus roseus（L.）G.Don莖的韌皮部中分離出尖孢鐮刀菌，為該植物的一種內生真菌，并用TLC和HPLC對該菌的97CG3菌株培養物進行了分析，初步結果表明，該真菌能產生抗癌藥長春新堿成分。

潘揚等[28]通過急性毒性實驗及致炎、溶血作用比較了巴豆經炮制與發酵后的毒性效應，結果表明，炮制和發酵處理均可使巴豆毒性降低，但巴豆靈芝菌和白僵菌發酵品毒性更低。

1.2 發酵在毒性動物類中藥中的應用

事實上，與植物類中藥相比，發酵應用于毒性動物類中藥的研究報道很少。斑蝥主要含斑蝥素、脂肪等成分，臨床用于破血消癓，功毒蝕瘡，引赤發泡。斑蝥素對多種實驗動物腫瘤有一定抑制作用，尤其當腹水型腫瘤接種的瘤細胞數較少時，可見小鼠生存期延長。其作用機制可能是抑制蛋白質與核酸的合成。臨床上對皮膚、粘膜有強烈的刺激性，能引起充血，起泡，口服毒性很大，米炒能降低其毒性及矯正其氣味。李曉飛等[29]從鋸角豆芫菁Epicauta gorhami Marseul幼蟲蟲體身上分離得到的白色真菌，經鑒定為球孢白僵菌Beauveria bassian，球孢白僵菌可以有效地降解斑蝥素，降解率達90.45%，可以利用這一研究來安全合理地應用斑蝥素，并可以深入研究斑蝥素的生物降解產物的藥物活性。葉敏等[30]往桔梗懸浮培養體系中加入斑蝥素培養6 d，培養液分離純化得到混合存在的兩個轉化產物，鑒定為一對差向異構體1β-羥基斑蝥素和1α-羥基斑蝥素，且均為未見報道的新化合物。

水蛭素（hirudin）因最早從水蛭中分離得到而得名。天然水蛭素由65個氨基酸殘基組成，相對分子質量7 000。水蛭素能同凝血酶的催化中心及纖維蛋白原結合中心發生不可逆的結合，使凝血酶失活，為目前發現的最強有力的凝血酶抑制劑。研究表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發揮作用，它能防止腫瘤細胞的轉移，已證明有效的腫瘤有纖維肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤和白血病細胞等。水蛭素配合化學治療和放射治療，可促進腫瘤中的血流從而增強療效。然而，水蛭素能阻止凝血酶的作用，引起內臟廣泛出血。有腎毒性，可導致腎臟損害。莫煒等[31]構建了重組雙功能水蛭素（r-RGD-Hirudin）cDNA的表達質粒 RGD-Hirudin.pPIC9K，轉化入畢赤酵母中，經篩選得到高表達的陽性克隆。種子菌經過3 d發酵培養，其培養液上清液經超濾濃縮、凝膠過濾層析和離子交換層析后，得到純度大于97%、比活性為12 000 ATU/mg的r-RGD-Hirudin，回收率大于60%，發酵產率為1 g/L。純化后r-RGD-Hirudin經過SDS-PAGE，抗凝血酶活力分析、抗血小板聚集分析、質譜分析及等電聚焦分析等方法鑒定，證明該表達產物為水蛭素的衍生物，具有抗凝血酶和抗血小板聚集雙重功能。周祥山等[32]研究重組畢赤酵母高密度發酵表達水蛭素過程中產生了4種具有較高比活的水蛭素異構體，畢赤酵母發酵過程中水蛭素存在降解，Hir 65降解產生了Hir 62和Hir63。

劉高強等[33]研究了幾種藥用昆蟲對靈芝深層培養過程中細胞生長和三萜產物形成的影響。結果表明，蜣螂蟲粉的添加，能顯著促進靈芝胞外三萜的形成（P＜0.01）。劉高強等[34]還研究了幾種昆蟲的水提物和醇提物對靈芝深層發酵生產菌體和多糖的影響。結果表明，松毛蟲水提物能促進靈芝菌體的生長，其中斑蝥提取物對靈芝菌體的生長表現出明顯的抑制作用。蜣螂水提物能顯著提高靈芝胞內多糖的產量，地鱉蟲醇提物以及松毛蟲醇提物對胞內多糖的生產也具有促進作用。此外，蜣螂醇提物對胞外多糖的生產具有促進作用。劉高強等[35]采用體外高通量篩選技術檢測了補加藥用昆蟲蜣螂前后靈芝發酵產物的體外抗腫瘤活性。在補加蜣螂發酵后，胞外三萜樣品對BEL7402細胞的抑制作用得到了增強，提示lucidone C可能增強了補加蜣螂后靈芝胞外總三萜對BEL7402細胞的抑制作用。以上都是研究昆蟲對靈芝發酵后的影響，中藥很多毒類藥材都有毒性，如斑蝥、青娘子、紅娘子、全蝎和蜈蚣等，這方面的發酵解毒研究值得期待。

1.3 發酵在毒性礦物類中藥中的應用

要不是通過商業產品的生物浸出而回收金屬的技術，發酵應用于毒性礦物類中藥幾乎不可能[36]。雄黃是常用的礦物藥，雄黃和含雄黃中成藥有多種療效，在中藥中具有舉足輕重的地位。但是雄黃常以未溶解狀態的粗糙礦物原粉入藥，造成用量大、毒性嚴重超標，常有使用雄黃造成不良反應者。因而雄黃和含雄黃中成藥在國際市場上受到了限制。杜文靜利用分離鑒定的一株高活性的氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，簡稱 At.f）對礦物藥雄黃進行浸出處理，比較普通氧化亞鐵硫桿菌和經耐砷馴化后的氧化亞鐵硫桿菌對雄黃的浸出效果，測定雄黃微生物浸出液的急性毒性，并初步研究雄黃微生物浸出液的體外、體內抑菌作用。謝親建研究采用微生物對雄黃進行生物浸出處理以提高其溶解度和生物利用度；以白血病K562和K562ADM細胞為模型，研究了雄黃的浸出液對腫瘤細胞增殖的影響及其誘導細胞凋亡的作用；采用毛細管電泳分析法對雄黃生物浸出液進行分離分析以期確定它的藥效成分；對雄黃生物浸出液的急性毒性和藥物動力學進行考察。李紅玉研究的雄黃微生物浸出液在制備抗腫瘤藥物中的應用已經申請專利。

朱砂是常用的鎮靜安神藥，在中藥中具有舉足輕重的地位。但是朱砂常以未溶解狀態的粗糙礦物原粉入藥，造成用量大、毒性嚴重超標，常有使用朱砂造成不良反應者。因而朱砂和含朱砂中成藥在國際市場上受到了限制。蘇麗春[35]利用分離鑒定的一株高活性的At.f對礦物藥朱砂進行浸出處理，研究其搖瓶浸出的最佳實驗條件，對朱砂浸出液的鎮靜安神和抗驚厥藥效實驗進行了初步的探討，并初步檢驗了朱砂浸出液的抑菌效果。

2 展望

中藥經過發酵有很多優點，目前對優良菌種的篩選、優化發酵終點的判斷，對已有活性成分和新成分的提取分離等研究較多，而對發酵減毒增效機理研究較少，建立發酵制品推廣應用大規模生產的質量標準尚屬空白。天然培養基中添加適量中藥成分的混合培養基研究有望成為未來的研究熱點。

我們認為對發酵中藥的研究可以從以下幾個方面開展工作：1）加強功能性微生物的菌種選育工作；2）毒性中藥發酵減毒增效分子機理研究；3）中藥發酵技術及設備的研究；4）復合微生物發酵技術的研究；5）研究在發酵中藥過程中如何實現中醫理論的指導并采納現代中醫藥的新技術、新成果。

對中藥的成分進行生物轉化，通過藥理篩選模型來確定轉化前后藥效的變化，需要中藥學、微生物學、分析化學、藥理學等多學科參與。隨著多學科的交叉發展，微生物發酵在有毒中藥的研究中必將取得長足的發展，微生物發酵中藥也必將表現出強大的生命力。應用現代生物技術大規模提取中藥的有效成分、將發酵技術應用于有毒中藥的炮制是一項很有前景的課題。同時，利用微生物發酵便于實現產業化和與國際標準接軌，對擴大中藥治療范圍、劑型改進、創制新藥方面提供新的技術手段，有利于提高我國中藥綜合利用的現代化水平，給中藥研究注入新的內容和活力，為中藥走向世界、造福全人類起著進一步的推動作用。

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