創(chuàng)傷弧菌控制措施與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究進(jìn)展*

姬華，陳艷，劉秀梅，付萍，李志剛，李敬光

1(國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100021)2(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122) 3(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子，832000)

創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，簡(jiǎn)稱(chēng)Vv)是一種低度嗜鹽菌，屬于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬(Vibrio)。創(chuàng)傷弧菌為革蘭氏陰性細(xì)菌，有動(dòng)力，單獨(dú)存在，或尾端相連成“C”或“S”型，該菌適于生長(zhǎng)在堿性環(huán)境中，對(duì)酸性環(huán)境敏感。Roland于1970年首先報(bào)道由創(chuàng)傷弧菌感染引起的小腿壞疽和內(nèi)毒素性休克，Hollis等于1976年從血液中分離培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌，該菌于1979年被命名為Vibrio vulnificus［1］。隨后，美國(guó)、日本相繼報(bào)告創(chuàng)傷弧菌感染臨床病例，姜紅于1991年報(bào)道了我國(guó)首例創(chuàng)傷弧菌引起的原發(fā)性敗血癥［2］。

創(chuàng)傷弧菌引起的疾病潛伏期一般在24～28 h。單獨(dú)引起胃腸炎的病例較少。胃腸炎主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉(呈水樣便)、惡心、嘔吐，多無(wú)發(fā)熱。罹患肝病的個(gè)體及免疫功能低下者，一旦感染創(chuàng)傷弧菌，更容易發(fā)生致命的傷口感染和原發(fā)性敗血癥，原發(fā)性敗血癥的病死率超過(guò)50%［3］。創(chuàng)傷弧菌分為3種類(lèi)型:吲哚陽(yáng)性的生物Ⅰ型對(duì)人類(lèi)致病，吲哚陰性的生物Ⅱ型對(duì)人類(lèi)和鰻魚(yú)致病，1996年從以色列病人分離的創(chuàng)傷弧菌為生物Ⅲ型菌株。

1 創(chuàng)傷弧菌的控制措施

1.1 溫度和鹽度

創(chuàng)傷弧菌是一種嗜溫菌，水溫在20～30℃，菌量較高。溫暖水域中創(chuàng)傷弧菌的濃度顯著高于寒冷水域中創(chuàng)傷弧菌的濃度。創(chuàng)傷弧菌的最適生長(zhǎng)溫度為37℃，當(dāng)水溫低于20℃，創(chuàng)傷弧菌在自然水域環(huán)境中的種群濃度很低，創(chuàng)傷弧菌最低生長(zhǎng)溫度為13℃［4－6］。創(chuàng)傷弧菌種群數(shù)量高峰出現(xiàn)在夏季，人群患病率呈季節(jié)性變化，疾病多發(fā)在夏秋高溫季節(jié)［7］。雖然創(chuàng)傷弧菌嗜溫，但對(duì)50℃以上的溫度卻非常敏感。利用創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)特性，可以通過(guò)冷藏、冷凍、低中溫巴氏殺菌等措施有效降低海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的風(fēng)險(xiǎn)。

不同生理亞種和形態(tài)的創(chuàng)傷弧菌對(duì)溫度變化的適應(yīng)性也各不相同，Watanabe等［8］研究發(fā)現(xiàn)，25℃條件下，創(chuàng)傷弧菌生物Ⅰ型、生物Ⅱ型和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)在肉湯中繁殖并分泌大量金屬蛋白酶。

37℃肉湯培養(yǎng)，創(chuàng)傷弧菌生物Ⅰ型和生物Ⅱ型生長(zhǎng)并且分泌金屬蛋白酶，鰻弧菌不生長(zhǎng)也不產(chǎn)生金屬蛋白酶;在人類(lèi)血漿中，只有創(chuàng)傷弧菌生物Ⅰ型穩(wěn)定繁殖并產(chǎn)生胞外金屬蛋白酶，表明生物Ⅰ型的生長(zhǎng)能力與人類(lèi)系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)。創(chuàng)傷弧菌生物Ⅱ型能利用水體作為感染路徑。在5～25℃條件下，創(chuàng)傷弧菌Ⅱ型能在人工海水中存活50 d。當(dāng)暴露在5℃低溫下進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(VBNC，Viable but non-culture)。從5℃增加到25℃后，生物Ⅱ型細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)，恢復(fù)培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)鰻魚(yú)和小鼠具有感染性，而休眠的細(xì)胞失去了毒力［9］。

Dombroski等［10］使用選擇性培養(yǎng)基從野生型(Vv-WT)中選擇培育了1株抗萘啶酸的創(chuàng)傷弧菌菌株(Vv-NA)。在－20℃、－80℃、液氮條件下，Vv-NA和Vv-WT具有相同的失活曲線(xiàn)。47～52℃熱處理，二者的D值幾乎一樣。不透明菌株細(xì)胞外層具有莢膜，而透明菌株沒(méi)有莢膜。Kim等［11］發(fā)現(xiàn)不透明創(chuàng)傷弧菌的Z值(2.4～2.5℃)顯著高于透明菌株的Z值(1.7～2.1℃)，說(shuō)明莢膜對(duì)細(xì)菌具有保護(hù)作用，提高了細(xì)菌的耐熱性。除了莢膜的保護(hù)作用，過(guò)氧化氫酶也能對(duì)創(chuàng)傷弧菌起到保護(hù)作用，提高VBNC細(xì)胞的復(fù)蘇率［12］。

低溫?zé)崽幚硪殉蔀楸泵赖貐^(qū)水產(chǎn)品加工的重要輔助方式。Cook等［13］發(fā)現(xiàn)低溫巴氏殺菌(50℃，10 min)能使去殼牡蠣中的創(chuàng)傷弧菌從105 MPN/g下降至檢測(cè)不到的水平;50℃處理牡蠣15 min，能徹底殺死創(chuàng)傷弧菌;用冰貯藏的牡蠣中創(chuàng)傷弧菌降低到2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，但不能徹底殺死腐敗菌［14］。水溫67℃保持約5 min，牡蠣中的創(chuàng)傷弧菌降低2～4個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)［15］。牡蠣勻漿中的創(chuàng)傷弧菌比緩沖液中的創(chuàng)傷弧菌更耐熱，可能是由于海產(chǎn)品蛋白對(duì)創(chuàng)傷弧菌的保護(hù)作用［16］。但是 Ruple等［17］認(rèn)為，商業(yè)熱處理并不能有效的控制牡蠣中的創(chuàng)傷弧菌，推薦使用冷藏牡蠣以延長(zhǎng)貨架期，減少創(chuàng)傷弧菌的危害。

冷藏與冷凍只能降低創(chuàng)傷弧菌的數(shù)量，抑制創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)，卻不能徹底殺死創(chuàng)傷弧菌。Cook［4］發(fā)現(xiàn)低于13℃，創(chuàng)傷弧菌在牡蠣中不繁殖，18℃貯存條件下創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)速率低于室溫條件(23～34℃)的生長(zhǎng)速率。創(chuàng)傷弧菌注入去殼的太平洋牡蠣和東歐牡蠣，4℃下至少存活6 d，冷藏處理貝類(lèi)和去殼牡蠣中殘存的創(chuàng)傷弧菌仍具有潛在的致病力［18］。創(chuàng)傷弧菌在冷藏或冷凍處理過(guò)程中還具有一個(gè)冷適應(yīng)過(guò)程。從15℃放至－78℃冷凍的細(xì)胞比從35℃放至－78℃冷凍的細(xì)胞更易于培養(yǎng)。冷適應(yīng)與“保護(hù)”蛋白的表達(dá)有關(guān)，培養(yǎng)基中除去鐵，創(chuàng)傷弧菌比同溫度條件培養(yǎng)下降了2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，說(shuō)明低溫條件下鐵對(duì)創(chuàng)傷弧菌起到重要的保護(hù)作用［19］。恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)，創(chuàng)傷弧菌平板涂布培養(yǎng)比傾注培養(yǎng)具有更高的恢復(fù)性。加入丙酮酸鈉或過(guò)氧化氫酶提高了VBNC細(xì)胞在5℃低溫條件下的復(fù)蘇率和存活率;缺乏營(yíng)養(yǎng)素培養(yǎng)創(chuàng)傷弧菌能夠提高其冷抗性和熱抗性［20－21］。

創(chuàng)傷弧菌存在于鹽度為0.08%～3.50% 的水體中［22］。Kaspar等［5］發(fā)現(xiàn)鹽度過(guò)高不利于創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)，創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的最適鹽度為0.5% ～2.5%，當(dāng)鹽度為3.0%、3.5%、3.8%，創(chuàng)傷弧菌的濃度分別下降58%、88%和 83%。Motes等［6］發(fā)現(xiàn)，鹽度超過(guò) 2.8%，則創(chuàng)傷弧菌濃度降低。溫度和鹽度顯著影響創(chuàng)傷弧菌生物Ⅱ型的生長(zhǎng);創(chuàng)傷弧菌生物Ⅱ型的最佳生長(zhǎng)鹽度為1.5%;鹽度降低，存活率較低;最佳生長(zhǎng)溫度取決于鹽度，25℃條件下該菌生長(zhǎng)的最低鹽度范圍在0.3%～0.5%，12℃條件下該菌生長(zhǎng)的最低鹽度范圍在1.5% ～3.8%［23］。

1.2 超高壓和輻照

創(chuàng)傷弧菌對(duì)壓力非常敏感，在25℃條件下，250 MPa處理10 min，肉湯中的創(chuàng)傷弧菌下降至檢測(cè)不到的水平，VBNC細(xì)胞似乎更能抵抗超高壓的致死作用［24］。Weibull方程適于預(yù)測(cè)超高壓滅活弧菌，而費(fèi)米方程更適于預(yù)測(cè)輻照滅活弧菌［25－26］。

創(chuàng)傷弧菌對(duì)輻照非常敏感。Mallett等［27］發(fā)現(xiàn)0.1 kGy的輻照劑量能殺死霍亂弧菌(Vibrio cholerae)和創(chuàng)傷弧菌。Mahmoud［28］利用 0.75、1.0、3.0 KGy X射線(xiàn)處理牡蠣，牡蠣中創(chuàng)傷弧菌下降超過(guò)6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，牡蠣的感官質(zhì)量沒(méi)有發(fā)生變化。Andrews等［29］發(fā)現(xiàn)1.0 kGy的輻照劑量能使染菌帶殼牡蠣中的創(chuàng)傷弧菌(107個(gè)/g)下降至檢測(cè)不到的水平。

1.3 體外和體內(nèi)模擬環(huán)境

牡蠣體內(nèi)存在抗菌物質(zhì)，而噬菌體也能有效降低創(chuàng)傷弧菌的數(shù)量［30］。3種創(chuàng)傷弧菌和噬菌體在37℃時(shí)暴露于模擬胃液中，研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌和噬菌體在胃酸條件下存活，而在小腸中繁殖，對(duì)膽鹽具有抗性［31］。Wong 等［32］探討了熱、酸、膽汁和低鹽對(duì)創(chuàng)傷弧菌YJ03的交叉保護(hù)作用。結(jié)果表明，酸(pH值4.4)、熱(41℃)對(duì)創(chuàng)傷弧菌沒(méi)有交叉保護(hù)作用。適應(yīng)低鹽(0.12%NaCl)的創(chuàng)傷弧菌細(xì)胞對(duì)12%的膽汁具有抗性。Paludan-Muller等［33］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)缺少碳或磷時(shí)，創(chuàng)傷弧菌通過(guò)合成獨(dú)特的蛋白在低溫下存活。當(dāng)缺少氮時(shí)創(chuàng)傷弧菌在低溫下不能培養(yǎng)。

1.4 食品添加劑

采用殼聚糖處理牡蠣中的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)和創(chuàng)傷弧菌，結(jié)果表明殼聚糖能有效抑制金黃色葡萄球菌，但對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和創(chuàng)傷弧菌沒(méi)有明顯的抑制作用［34］。創(chuàng)傷弧菌對(duì)含酚類(lèi)物質(zhì)的煙熏劑和大多數(shù)化學(xué)殺菌劑也很敏感［35－36］。0.05%雙乙酰處理牡蠣使創(chuàng)傷弧菌下降2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，而0.05%乳酸和丁基羥基茴香醚對(duì)創(chuàng)傷弧菌沒(méi)有作用，雙乙酰殺菌機(jī)理在于影響細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性及膜脂質(zhì)層形成［37－38］。

1.5 凈化和電離水

溫度影響凈化的效果，凈化海水的溫度高于23℃，牡蠣中創(chuàng)傷弧菌數(shù)量明顯增加;當(dāng)凈化海水保持15℃時(shí)，海水和牡蠣組織均未檢出創(chuàng)傷弧菌［39］。Groubert等［40］將創(chuàng)傷弧菌菌株(CVD713)接種牡蠣，凈化48 h，創(chuàng)傷弧菌下降至檢測(cè)不到的水平。延長(zhǎng)凈化時(shí)間(17～49 d)、保持高鹽度(＞3%)可以使創(chuàng)傷弧菌降低2～3個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。一般認(rèn)為凈化不能徹底清除海產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌［41］。

比起凈化稀釋細(xì)菌濃度的作用，電離水更能有效地抑制牡蠣中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)。用含鹽0.5%的電離水中處理副溶血性弧菌(8.74×107個(gè)/mL)和創(chuàng)傷弧菌(8.69×107個(gè)/mL)15 s后，兩種弧菌下降至檢測(cè)不到的水平。為了避免牡蠣死亡，電離水的處理時(shí)間最好限制在 4 ～6 h［42］。

2 創(chuàng)傷弧菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

歐盟在食品衛(wèi)生法典委員會(huì)第33屆會(huì)議上提議開(kāi)展創(chuàng)傷弧菌—牡蠣組合的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［43］。McCoubrey［44］報(bào)道了生食北島牡蠣的創(chuàng)傷弧菌感染風(fēng)險(xiǎn)，指出高鹽等環(huán)境條件不利于創(chuàng)傷弧菌的生存。歐盟家畜公共衛(wèi)生措施科學(xué)委員會(huì)完成了生食和半生食海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的報(bào)告。該報(bào)告遵循風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模式，注意到全球創(chuàng)傷弧菌污染率的變化［45］。

世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織對(duì)美國(guó)墨西哥灣生食牡蠣中的創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。收獲牡蠣中創(chuàng)傷弧菌的污染水平主要受水溫和鹽度的影響。對(duì)于鹽度低于3%水域收獲的牡蠣，估計(jì)夏季創(chuàng)傷弧菌污染水平最高(5.6×103CFU/g)，冬季最低(8.0×101CFU/g)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型估計(jì)采后貯藏期間創(chuàng)傷弧菌污染水平將會(huì)大幅增加，預(yù)測(cè)夏季平均水平為5.7×104CFU/g，冬季為8.0×101CFU/g。如果食用196 g牡蠣肉，估計(jì)夏季攝入創(chuàng)傷弧菌的劑量為1.1 ×107CFU/g，冬季為1.6×104CFU/g。采用貝塔-泊松劑量反應(yīng)模型，估計(jì)在目前的收獲和貯藏條件下，冬、春、夏、秋季創(chuàng)傷弧菌感染病例分別為0.5、11.7、12.2、8.0 例。如果創(chuàng)傷弧菌污染水平降至300、30、3 CFU/g，估計(jì)全年病例數(shù)分別為 7.7、1.2、0.16 例［46］。

國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心開(kāi)展對(duì)蝦中創(chuàng)傷弧菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究，構(gòu)建對(duì)蝦中創(chuàng)傷弧菌的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型［47］。該模型模擬了從零售到餐桌，由于消費(fèi)對(duì)蝦引起創(chuàng)傷弧菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。模型估計(jì)了污染創(chuàng)傷弧菌的對(duì)蝦數(shù)量，經(jīng)過(guò)購(gòu)買(mǎi)、運(yùn)輸、貯存、制備等步驟后對(duì)蝦中創(chuàng)傷弧菌菌量的增減。通過(guò)劑量反應(yīng)關(guān)系模型計(jì)算我國(guó)因食用污染創(chuàng)傷弧菌的對(duì)蝦引起創(chuàng)傷弧菌疾病的概率。食用含有創(chuàng)傷弧菌的對(duì)蝦所引起的疾病感染概率為1.977×10－5，即每百萬(wàn)人有19.8人發(fā)病。模型估計(jì)的人群創(chuàng)傷弧菌發(fā)病率與美國(guó)、日本和韓國(guó)報(bào)道的人群發(fā)病率非常接近。敏感性分析發(fā)現(xiàn)，購(gòu)買(mǎi)對(duì)蝦后的家庭常溫貯藏時(shí)間與對(duì)蝦中創(chuàng)傷弧菌的初始污染濃度對(duì)風(fēng)險(xiǎn)的影響較大。通過(guò)改變參數(shù)，模型評(píng)估了幾種風(fēng)險(xiǎn)控制措施的效果，如中溫處理、超高壓處理、縮短購(gòu)買(mǎi)對(duì)蝦后的家庭常溫貯藏時(shí)間和降低零售階段對(duì)蝦中創(chuàng)傷弧菌的初始濃度。研究結(jié)果提示監(jiān)管部門(mén)有必要增加對(duì)蝦等海產(chǎn)品的創(chuàng)傷弧菌監(jiān)測(cè)指標(biāo)，以便為相關(guān)部門(mén)制定風(fēng)險(xiǎn)管理措施提供科學(xué)依據(jù)。

3 展望

相比于其他的弧菌和食源性病原體，創(chuàng)傷弧菌對(duì)食品加工中許多常用的殺菌措施都極為敏感。凈化措施對(duì)于清除創(chuàng)傷弧菌的作用不大，因?yàn)榧?xì)菌存在于海產(chǎn)品的不同組織中。創(chuàng)傷弧菌屬于低度嗜鹽菌，高鹽不利于創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)外對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)和存活的數(shù)學(xué)建模研究還不夠深入，大多數(shù)研究?jī)H僅探討殺滅創(chuàng)傷弧菌的D值和Z值。深入研究細(xì)菌生長(zhǎng)特征，建立數(shù)學(xué)模型，改變加工、貯藏參數(shù)以控制食品中創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)，對(duì)于有效控制創(chuàng)傷弧菌污染，完善海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的風(fēng)險(xiǎn)管理措施非常重要。

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