RNA干擾及其在植物研究中的應用

王婷婷 王丹丹 Rahman Laibi Chelab 康丹游騰飛 眭安平 楊星勇

（1. 西南大學生命科學學院，重慶 400715；2.西南大學圖書館，重慶 400715）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）在20世紀90年代被發現，是指內源性或外源性雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）導致細胞內同源mRNA發生特異性降解的過程［1]。RNA干擾現象普遍存在于真菌、果蠅、線蟲、渦蟲、植物及動物等大多數真核生物中，它可以阻斷生物體內特定基因的表達，從而使細胞表現出特定基因缺失的表型，是一種在進化上高度保守的調節機制［2]。RNA干擾現象自被發現后，迅速發展成為一種強大的基因沉默工具，是當今生物學研究的一大熱點，現在對RNA干擾的作用機理和特點的研究已取得很大進展。同時，對RNA干擾在植物研究上的應用也取得豐碩成果，植物體可以利用RNA干擾來抵御病毒或者外來核酸的侵入，從而保護機體免受病毒等侵害。此外，利用RNA干擾技術可以進行植物基因功能分析、基因表達和調控、作物品種改良和抗病蟲害等。隨著研究的不斷深入，RNA干擾將在植物學研究領域發揮越來越重要的作用。

1 RNAi的作用機制

自從Fire等［3]發現雙鏈RNA可以誘導生物體內同源靶標基因降解并將其命名為RNAi后，人們對RNAi進行了大量的研究，對RNAi的作用機制也在不斷的探索當中，目前認為RNAi可以分為以下3個階段：起始階段、效應階段和擴增階段。

1.1 起始階段

dsRNA是誘導細胞產生RNAi的關鍵成分，轉基因、病毒感染及轉座子活動等都能使細胞產生dsRNA。這些dsRNA在內切核酸酶，即Dicer酶的作用下加工裂解形成21-25nt的dsRNA片段，這些片段被稱為小干擾RNA（short interfering RNAs，siRNA）。Bernstein等［4]通過對果蠅進行試驗發現，RNAi過程中降解dsRNA的關鍵酶是CG4792，并將其命名為Dicer。Dicer是RNaseⅢ家族中的成員，它含有解旋酶結構域、PAZ結構域、RNaseⅢ催化區域和dsRNA結合結構域，在其他生物體內也發現了Dicer類似物。siRNA分子兩條單鏈的3'端是羥基且具有2個突出的非配對堿基，5'端的磷酸基團會被一種特殊的激酶保護起來，這一結構是siRNA進入效應階段所必須的。

1.2 效應階段

起始階段產生的siRNA進一步與多種蛋白成分結合，形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC的組成包括Argonaute家族蛋白、內切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA鏈搜索活性等，其第一個亞單位為siRNA［5]。緊接著，在RNA解旋酶的作用下，RISC中的siRNA解鏈和正義鏈被去除，反義鏈與靶mRNA分子互補結合并切割靶mRNA分子，從而阻斷基因的表達。

1.3 擴增階段

以mRNA為模板，siRNA為引物，在RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRp）作用下，通過類似PCR的擴增作用再次形成dsRNA，dsRNA又被Dicer切割產生次級siRNA，次級siRNA又進入下輪循環，這樣就產生了一種級聯放大的效應［6]。因此，只需要極少的dsRNA，就可以產生強大的沉默效應。Chen等［7]發現在植物中，22 nt的siRNA對次級siRNA的形成起著關鍵作用。

2 植物RNAi作用的特點

2.1 具有高度序列特異性

Brummelkamp等［8]利用RNAi沉默人的MCF-7基因時發現，siRNA上一對堿基突變會抑制沉默效應，植物RNAi也存在這種高度的序列特異性，RNAi這種特性使得dsRNA只能特異地降解與之序列同源的mRNA，而不能對其他基因產生影響，這樣就保證了對目的基因的精確沉默。

2.2 沉默基因的高效性

由于RNAi存在級聯放大效應，RNAi途徑一旦被啟動，就可以高效沉默基因的表達，因此每個細胞只需少量的dsRNA就可以使目標基因沉默［9]。向細胞內導入針對多個基因的dsRNA，還可以一次性沉默多個基因。Kubo等［10]經過研究后發現，與棕櫚酸結合的27 nt dsRNAs（C16-dsRNAs）具有很高的膜通透性，而且具有很高的基因沉默效率。

2.3 RNAi的可擴散性和遺傳性

目前已有大量的資料證實，在植物RNAi過程中siRNA充當沉默信號［11]。沉默信號可以在植物體內傳遞，局部傳遞通過胞間連絲實現，長距離傳遞通過韌皮部進行；通過嫁接沉默信號可以在砧木和接穗之間雙向傳遞，而且沉默信號可以在不同的物種個體間傳遞。如植物與取食植物的昆蟲之間，沉默效應甚至可以傳遞給后代［12]。

2.4 沉默信號的高穩定性

siRNA的3'端有突出的TT或UU堿基，因此化學性質很穩定，無須像反義核苷酸那樣進行廣泛的化學修飾以提高半衰期［1]。

3 RNAi在植物中的應用

RNAi具有特異性、高效性、作用迅速和高穩定性等特點，利用RNAi技術的這些特點可以進行植物基因功能分析，并對某些基因的表達進行調控，也可以對植物進行改良。另外，RNAi在植物抗病蟲、抗逆性等方面也有重要的作用?？傊?，RNA干擾作為一種反向遺傳學的研究方法，為植物基因組學的發展提供了一個很好的技術平臺。

3.1 植物基因功能分析

人類已經進入后基因組時代，基因組學的重心已由結構基因組學轉向功能基因組學，RNAi技術以其高度專一性和作用迅速等特點，為研究功能基因組學提供了一個高效、便捷的平臺。利用RNAi研究植物基因功能已取得了較大進展，Gong等［13]在研究SOS2家族的蛋白激酶基因PKS時發現，將PKS18導入擬南芥中后，轉基因植株對ABA敏感，當用RNAi將PKS18沉默后，植株對ABA不敏感。由此證明，PKS18與ABA信號轉導有關。Nishihara等［14]從煙草的花瓣上分離克隆了查耳酮異構酶（CHI）基因，并利用RNA干擾對其進行研究，結果發現，該基因可影響煙草花瓣顏色和類黃酮的積累。Xu等［15]利用RNA干擾技術研究水稻OsPIN1發現，在轉基因水稻中不定根的生長和發育明顯受到抑制，因此研究者認為0sPIN1基因在水稻不定根的發生和發育上有重要作用。PIN2是在茄科植物中發現的絲氨酸蛋白酶抑制劑，Sin等［16]利用RNA干擾技術使PIN2基因的表達受阻，結果種子的形成受到影響。通過細胞學和分子生物學分析表明，該基因表達降低使得種子的內表皮發育不正常，最終造成種子敗育。由此證明，PIN2基因與內種皮的發育有關。通過對基因家族中高度保守的序列構建RNAi載體，可以對整個基因家族進行功能分析，已有科學家利用此方法對基因家族功能進行分析。

3.2 植物改良方面的應用

在植物改良方面，RNAi顯示了極大的優勢，與傳統的育種方式相比，它不僅可以縮短育種周期，而且可以特定的改變農產品的某種品質，從而滿足人們的特定需求。番茄是類胡蘿卜素和黃酮類化合物的主要食物來源，Davuluri等［17]利用RNAi技術，特異地抑制了番茄內源性光形態建成調節基因DET1的表達，相應的類胡蘿卜素和黃酮類化合物的含量提高，這表明通過對調控基因進行沉默，可以同時影響幾個擁有不同合成途徑的植物營養素的產量，為改變農作物營養價值提供了一個很好的方法。利用生物學方法降低煙草中的有害成分，一直是人們關注的問題。研究發現，N亞硝基去甲煙堿（NNN）能導致試驗動物發生癌變，NNN是去甲煙堿亞硝化形成的，而去甲煙堿是尼古丁在脫甲基酶作用下形成的次級生物堿。因此，通過降低去甲煙堿的含量即可起到降低有害成分NNN的作用。Lewis等［18]利用RNAi技術沉默了煙草中的脫甲基酶基因發現，轉基因煙草中的去甲煙堿的含量與對照相比降低了6倍，NNN的含量也明顯降低。青蒿素是從艾草中分離出來的一種抗瘧疾藥物，但它在艾草中的含量很低。Zhang等［19]研究了艾草中的一種鯊烯合酶SQS，該酶是固醇合成途徑的關鍵酶，而固醇合成通路影響青蒿素的合成，他們利用發夾RNA介導的RNAi技術沉默SQS的表達，在得到的陽性轉基因植株中青蒿素含量顯著增加。這個結果表明，RNAi在改變植物代謝物含量方面有重要作用。

3.3 植物抗病毒研究中的應用

在植物中，RNAi具有抵抗病毒入侵的作用，是植物抵抗病毒感染的防御機制之一。體外設計合成與病毒同源的dsRNA，然后將其導入植物體，當用相同的病毒感染植物時，植物會通過RNAi機制對病毒轉錄的mRNA進行切割降解，從而阻止病毒的復制擴張，進而保護植物體不受病毒危害。Andika等［20]利用RNAi使煙草獲得了抗甜菜壞死黃葉病毒的抗性，而且發現煙草葉片對病毒的抗性強于根部。Shimizu等［21]利用RNAi沉默了水稻矮縮病毒的一個病毒原質基質蛋白基因Pns12，結果轉基因水稻獲得了對該病毒抗性，他們認為利用RNAi沉默病毒復制相關蛋白，可以高效的控制農作物病毒感染。Zhang等［22]以苜?；ㄈ~病毒、豆莢斑點病毒和大豆花葉病毒的保守序列為模板，分別構建了大約150 bp的短反向重復序列，將這3種結構組裝進表達載體后導入大豆植株，最后獲得3株轉基因植株，且其對3種病毒都具有抗性。Zhou等［23]利用RNAi研究水稻條紋病毒（RSV），構建了針對RSV外殼蛋白和疾病特異性蛋白的兩種沉默表達載體，然后將它們導入水稻品種Suyunuo and Guanglingxiangjing，結果轉基因水稻對RSV的抗性都增加。這些研究都證明，利用RNAi可以有效的抵抗病毒對植物的傷害。

3.4 植物抗蟲害方面的應用

在植物抗蟲方面，利用RNAi也取得了很多研究進展。Mao等［24]在棉花中表達了針對P450基因CYP6AE14的雙鏈RNA，棉鈴蟲食用了此種轉基因植物后，CYP6AE14基因的表達顯著降低，對棉酚的耐受性大大減弱，棉鈴蟲生長變得緩慢。Sindhu等［25]向擬南芥中導入了4個甜菜孢囊線蟲生命周期相關基因的dsRNA，線蟲在取食RNAi植物后，其體內4個基因的表達都受到抑制，并且轉基因植株中成熟雌性線蟲的數量明顯減少。Zha等［26]利用RNAi研究了褐飛虱的中腸基因，他們將3種中腸基因的dsRNA導入水稻植株，然后喂食褐飛虱，結果發現，褐飛虱中這3種基因的表達都受到抑制，但是褐飛虱并沒有出現致命性死亡。Ibrahim等［27]將酪氨酸磷酸酶（TP）和線粒體應激70蛋白前體（MSP）的RNAi結構導入大豆根部，結果發現由根結線蟲引起的蟲癭減弱，同時根結線蟲與對照組相比個體也明顯變小。Matsunaga等［28]將南方根結線蟲POS-1基因的dsRNA接種到番茄的根部，接著用根結線蟲侵染根部發現，根結線蟲的孵化率與對照組相比明顯降低。以上研究表明，在植物中表達與昆蟲同源的雙鏈RNA，可以觸發取食昆蟲體內發生RNA干擾，進而影響昆蟲生長甚至殺死昆蟲。而且利用RNAi技術防治害蟲具有很高的特異性，不會對其他有益昆蟲產生影響。

3.5 植物抗逆性中的應用

RNA干擾技術應用于植物抗逆性方面的研究比較少。Kaplan等［29]研究發現，將擬南芥在4℃冷凍下處理，植株中的β-淀粉酶（BMY8）被誘導，且植株中積累了大量麥芽糖，而BMY8-RNAi株系經過4℃冷凍脅迫后，植株中麥芽糖的積累量很少，通過測定發現BMY8-RNAi株系的葉綠素熒光率Fv/Fm與野生型相比降低了。該研究表明，在凍脅迫作用下增加植物體內麥芽糖含量有助于保護電子傳遞鏈上的蛋白質 。Marzin等［30]利用瞬時誘導基因沉默（TIGS）的方法，篩選大麥干旱脅迫應答相關基因，結果發現，在干旱脅迫下有4個基因的表達量下降，而對照組則沒有任何變化，4個表達量下降的基因分別編碼大麥干旱應答因子HvDRF1、脫水蛋白6、胚胎發育后期豐富蛋白HVA1和液泡膜Na /H逆向轉運蛋白HvHNX1。Manavalan等［31]利用RNAi技術阻斷了水稻的鯊稀合酶基因，當在暗箱里干旱處理一段時間后發現，轉基因植株比野生型植株更晚表現出萎蔫癥狀，在其生殖期對其進行干旱處理，轉基因植株失水情況較輕，該研究為水稻抗旱提供了策略。利用RNAi篩選與抗逆性相關的基因，從而改造植株使其具有抗旱、抗溫度脅迫等抗性，將有利于植株在逆境中生存。

4 展望

RNAi介導的基因沉默是植物在基因調控水平上的自我保護機制，是一種高效、特異性強的基因阻斷技術，在植物基因功能研究、作物品種改良、病蟲害防治等方面發揮著重要作用。近年來RNAi發展迅速，為功能基因組學研究提供了有力工具，現已成為生物學研究的熱點之一。雖然RNAi的研究已經取得了很大的成果，但關于RNAi機制仍有很多問題沒有解決，如需要多少分子的siRNA才能敲除一個基因，哪些蛋白成分參與了siRNA在生物體內的擴散，RISC是如何精確識別正反兩條鏈；靶標mRNA的哪些性質會影響RNAi的穩定性等等。同時，RNAi的安全性也需進一步驗證。這些都阻礙了RNAi技術的發展，也影響了其在植物中的應用。不過，隨著植物基因組序列的不斷開發，以及人們對RNAi技術的不斷深入研究，該技術也將在植物各領域的研究中發揮越來越重要的作用。

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