單核細胞增生李斯特菌三種檢測方法的比較

張烜榕，顏軍，李文龍，侯敏，蔣玉佳，卜舒，李桂滿

（昆明市疾病預防控制中心，昆明650228）

單核細胞增生李斯特菌三種檢測方法的比較

張烜榕，顏軍，李文龍，侯敏，蔣玉佳，卜舒，李桂滿

（昆明市疾病預防控制中心，昆明650228）

目的：通過比較國標法、real-time PCR法和LAMP方法，得到適合基層實驗室快速檢測單核細胞增生李斯特菌的方法。方法：分別用國標法、real-time PCR法和環介導的等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法檢測李斯特菌，并進行方法比較。結果：三種方法對單增李斯特菌的檢測結果一致.國標法整個檢測過程需5~7 d；real-time PCR法實驗條件要求高，成本高，檢測需1.5~2.5 d；LAMP法實驗條件低，成本低，檢測時限與real-time PCR相同。結論：LAMP法檢測單增李斯特菌靈敏度高、特異性強、快速高效和低成本，適合基層實驗室應急檢測和現場監測使用。

國標法；LAMP；PCR；單核細胞增生李斯特菌檢測

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一類兼性細胞內生長的革蘭陽性桿菌，致病力較強，可引起人畜李斯特病，臨床表現為敗血癥、腦膜炎、單核細胞增多和胃腸炎，主要通過污染的肉類、乳制品和蔬菜等引起李斯特菌感染。國內外對單增李斯特菌高度重視，1986年WHO已將其列為食品四大致病菌之一，2000年在WHO食品安全工作計劃中，已將該菌列為重點檢測的食源性致病菌之一〔1〕。最近，美國從2011年7月31日出現首例李斯特病病例報告至同年12月8日，共報告病例146例，死亡30例，這是10多年來美國最嚴重的一起食源性疾病暴發事件〔2〕。所以及時有效的控制食品中LM的污染是食品安全的重要保障之一。

LM的鑒定方法有國標的分離鑒定法、免疫學鑒定法、PCR法等。分離培養鑒定法較簡單，但操作繁瑣，鑒定過程需要5~7 d，檢出限較低，費時費力，難以滿足突發事件的快速檢測要求。免疫學鑒定法由于菌體及鞭毛抗原交叉反應的存在，難以進行李斯特菌種間的特異性鑒別〔3〕。PCR法具有特異性強、靈敏度高和反應速度快的優點，但需要昂貴的PCR儀，且檢測成本高，不適宜基層實驗室使用。由Notomi等〔4〕在2000年設計的LAMP法是一種恒溫核酸擴增方法，該方法是通過4條特異性引物識別靶基因的6個區域和具有鏈置換活性的Bst（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶作用，在65℃的恒溫條件下擴增。與PCR不同，LAMP不需要精密的PCR儀和昂貴的試劑〔5〕，尤其適合在缺乏設備支持的基層實驗室和突發現場開展檢測工作。本實驗通過同時應用國標的分離鑒定法，PCR法和LAMP法檢測鑒定LM來比較LAMP方法在LM檢測中的高效性、準確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 菌株實驗室保存的李斯特菌11株。

1.2 主要試劑和儀器設備單增李斯特菌檢測試劑盒（熒光PCR法）購自深圳易瑞生物技術有限公司；單核細胞增生李斯特氏菌核酸檢測試劑盒（環介導恒溫擴增法）購自廣州華峰生物科技有限公司；瓊脂購自基因公司；10000×SYBR GreenI購自北京優尼康生物科技有限公司；全自動微生物生化鑒定儀（VITEK32）；上海一恒恒溫水浴鍋；BIO-RAD凝膠成像系統；北京八一六廠電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 國標法根據食品安全國家標準《食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》GB4789.30-2010分離鑒定菌株。李氏增菌肉湯LB1 30℃培養24 h，轉種李氏增菌肉湯LB2 30℃培養24 h，接種于PALCAM平板和李斯特氏顯色培養基36℃培養24 h，取菌落分別接種在木糖和鼠李糖發酵管36℃培養24 h，同時在TSA-YE上純化30℃培養24 h，選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的菌繼續進行全自動生化鑒定6~7 h，并依次進行動力試驗、生化鑒定和溶血試驗。

1.3.2 real-time PCR法取培養24 h的LB2增菌液1 mL，10 000 r/min離心2 min，棄上清，加入80 μL DNA提取液混勻煮沸裂解10 min，置冰上10 min，10 000 r/min離心2 min，上清即為模板。按試劑盒說明書準備反應體系，分別取5 μL陰性、陽性質控品和提取的DNA加入反應體系中。循環參數：預變性95℃10 min，1次循環；變性95℃10 s，退火、延伸及檢測熒光58℃45 s，40次循環。

1.3.3 LAMP法菌株DNA提取參見real-time PCR法。根據試劑盒說明書分別取2.5 μL陰性、陽性質控品和提取的DNA加入反應體系中，置65℃60 min。

1.4 結果判定

1.4.1 國標法VITEK32直接判讀結果后，進行后續的生化試驗鑒定。所用李斯特菌株生化反應特征，見表1。

表1 單核細胞增生李斯特氏菌生化特征與其他李斯特氏菌的區別

1.4.2 real-time PCR法陽性結果呈現典型的S型擴增曲線。Ct值≥38或undet為陰性結果，Ct值＜35為陽性結果，35≤Ct值＜38為檢測灰區，重復測定兩次，兩次測定Ct值≥38為陰性結果，其中一次Ct值＜38為陽性結果。

1.4.3 LAMP法肉眼觀察產物顏色變化，出現綠色判定為陽性，橙色為陰性。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，有不同大小的梯形條帶為陽性結果，不產生條帶為陰性結果。

2 實驗結果

2.1 國標法檢測11株李斯特菌中7株為LM，3株為英諾克李斯特菌，1株為伊氏李斯特氏菌，見表2。11株李斯特菌4株從速凍熟制米面制品中分離，3株從熟肉制品中分離，2株從即食非發酵性豆制品中分離，1株為省疾控下發質控，1株為國家臨檢中心下發考核樣。其中，檢出7株LM中除1株為省疾控下發質控樣外，其余為2株從速凍熟制米面制品中分離，2株從熟肉制品中分離，2株從即食非發酵性豆制品中分離；3株英諾克李斯特菌中1株從熟肉制品中分離，2株從速凍熟制米面制品中分離；1株伊氏李斯特菌是國家臨檢中心下發考核樣，見表2。說明李斯特菌對環境要求和營養要求都不高，可污染不同的食物，特別是加工后即食的食品。

2.2 real-time PCR法采用針對目標菌為LM的熒光PCR法分別對11株實驗菌株核酸進行擴增，其中有7株菌株PCR擴增呈現典型S型擴增曲線，Ct值均＜35，檢測結果為LM，其它4株李斯特菌為陰性，檢測結果與國標法一致，見表3。

表2 國標法檢測結果

表3 三種方法檢測單增李斯特菌結果比較

2.3 LAMP法恒溫擴增實驗菌株核酸，目測擴增產物，11株李斯特菌中有7株綠色為LM，其余橙色為其它李斯特菌，結果見圖1。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，7株LM菌株與陽性質控菌株一樣有相同的明亮的梯形條帶，4株非單增李斯特菌沒有典型的LAMP擴增條帶，見圖2。其LM檢測結果與國標法和real-time PCR法檢測一致，見表3。

圖1 LAMP法檢測單增李斯特菌目測結果

圖2 LAMP法檢測單增李斯特菌瓊脂糖電泳圖

3 討論

LM廣泛存在于自然界中，生存條件要求不高，在極端環境中仍可生長。該菌在5~45℃均可生長，經58~59℃10 min可殺死，在5℃低溫生長是典型特征之一，在-20℃可存活一年，能在冰箱冷藏室內較長時間生長繁殖，不易被凍融，耐堿不耐酸，在pH 9.6中仍能生長，在10%NaCl中可生長，在4℃的20%NaCl中仍可存活8周。該菌引起致病的物質為李斯特菌溶素O，此溶素須細菌被吞噬后在細胞內生長時釋放。幾乎所有被診斷為單增李斯特菌感染的患者均有侵襲性感染癥狀（即細菌從胃腸道擴散到血液或其他部分），突出的臨床表現為敗血癥、腦膜炎、腦脊髓炎、發熱，有時可引起心內膜炎。

隨著社會經濟的快速發展，生活節奏越來越快，人們對即食食品、冷藏和速凍食品的需求量迅速增加，這也同時增加了LM對人們的威脅，因此對LM進行快速、靈敏、準確的檢測能有效的保證食品安全衛生。本實驗選取的11株李斯特菌有分離于速凍熟制米面制品、熟肉制品和即食非發酵性豆制品，說明LM在我們周圍是普遍存在的，其生存條件要求不高，生存耐受力很強，在冰箱冷藏室內仍可生長繁殖的生存能力使其具有極高的感染人畜的潛在危險機率。本實驗通過用三種方法對LM檢測結果進行比較，獲得一種較為簡便易行的檢測方法。國標法是對分離培養后的可疑菌落通過生化試驗、動力試驗和溶血試驗等進行鑒定，檢驗過程需要5~7 d，耗時耗力、且操作復雜，不能達到迅速為食物中毒等食品安全突發事件提供病原學依據的要求。Real-time PCR法特異性強、靈敏度高，省時省力，其檢驗過程需要1.5~2.5 d，但需要昂貴的PCR儀，而且對試驗環境要求和操作人員技術的要求都很高，在一定程度上限制了其發展和應用。近年來的研究〔6-9〕表明LAMP法在檢測各種食源性致病菌方面具有很多優勢。本實驗應用LAMP法檢測了11株李斯特菌株，結果對其中7株LM的核酸均有擴增，對其余4株其它李斯特菌的核酸均無擴增，其結果與國標法和realtime PCR法一致，檢驗過程需1.5~2.5 d，顯示出該方法對LM的檢測的特異性、靈敏性和準確性不亞于PCR法，且對試劑要求簡單，儀器要求不高，只需要提供恒定溫度的設備即可，產物鑒定簡便易行，視覺觀察產物變綠的是LM，橙色是非單增李斯特菌，因而能在短時間內、簡單的實驗條件和要求不高的實驗環境下為食品安全突發事件提供快速的病原學的初步檢測依據。

綜上所述，通過對三種檢測鑒定方法的結果比較可知LAMP法檢測LM是三種檢測法中較簡便和快速的方法，與其它核酸擴增技術相比，具有實驗操作簡單、快速、成本低、對設備條件要求低等方面的優勢。其特異性強、靈敏度高、快速高效和產物鑒定簡便的優點，適合縣區級疾病預防控制中心快速檢測和現場監測等應用。

〔1〕嚴劍波，王虹玲，朱水榮，等.單增李斯特菌LMAP方法的建立〔J〕.中國衛生檢驗雜志，2009，19（9）：2048-2050.

〔2〕Multistate Outbreak of Listeriosis Linked to Whole Cantaloupes from Jensen Farms，Colorado〔EB/OL〕.〔2011-11-08〕.http：//www.cdc.gov/listeria/outbreaks/ cantaloupes-jensen-farms/index.html.

〔3〕巢國祥，周曉輝，焦新安.單核細胞增生性李斯特菌PCR快速檢測方法的建立及應用〔J〕.中國人獸共患病雜志，2004，20（9）：797-800.

〔4〕Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA〔J〕.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.

〔5〕肖斌，朱永紅，鄒全明.簡便敏感的環介導等溫擴增基因診斷新技術〔J〕.中華檢驗醫學雜志，2005，28（7）：761-763.

〔6〕Maruyama F，Kenzaka T，Yamaguchi N，et al.Detection of Bacteria Carrying the stx2 Gene by In Situ Loop-Mediated Isothermal Amplication〔J〕.App1 Environ Microbiol，2003，69（8）：5023-5028.

〔7〕Song T，Toma C，Nakasone N，et al.Sensitive and rapid detection of Shigella and enteroin vasive Escherichia coli by a loop-mediated isothermal amplification method〔J〕. FEMS Micribiol Lett，2005，243（1）：259-263.

〔8〕Yukiko H K，Nemoto J，Ohtsuka K，et al.Sensitive and rapid detection of Vero toxin-producing Escherichia coil using loop-mediated isothermal amplification〔J〕.Journal of Medical Microbiology，2007，56：398-406.

〔9〕侯敏，顏軍，張烜榕，等.環介導等溫擴增技術檢測技術檢測志賀氏菌的研究〔J〕.云南預防醫學雜志，2012，17（2）：28-31.

（責任編輯 李楊）

Comparison of Three Methods of Listeria monocytogenes Detection

ZHANG Xuanrong,YAN Jun,LI Wenlong,HOU Min,JIANG Yujia,BU Shu,LI Guiman
（Disease Control and Prevention Center of Kunming,Kunming 650228,China）

Objective:To find a suitable method for rapid detection of Listeria monocytogenes（LM）in grassroots labs.Methods: GB law,real-time PCR and LAMP were adopted to detect LM,then,the results were evaluated.Results:The results of the three mothods were quite consistent.The detection process of GB law took 5 to 7 days.While the real-time PCR requiring high experimental conditions and cost took 2.5 days.LAMP method,requiring low experimental conditions and cost,took the same time as the real-time PCR.Conclusion:The LAMP assay was a sensitive,specific,rapid and economical method for the detection of LM, which could be widely used by grassroots labs.

GB law;LAMP;PCR;detection of Listeria monocytogenes

R155.5

A

1672-2345（2013）06-0038-05

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.011

2012-09-16

2012-10-16

張烜榕，初級檢驗師，主要從事病原生物檢驗研究.