四維超聲對小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)的影響

李 超

（大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116023）

作為產(chǎn)前例行檢查的一個重要環(huán)節(jié)，超聲波檢查是有必要的.最近，能讓未出世的寶寶與父母提前見面的“胎兒寫真”服務(wù)，在北京、上海等大城市火了起來.所謂的“胎兒寫真”其實就是用四維超聲技術(shù)照出來的，不僅可以獲得照片，還能將影像制作成光盤.胎兒寫真與醫(yī)院B超檢查畢竟有所不同，為保證胎兒處于最佳姿態(tài)，如手不會擋住臉部等，四維彩超的操作時間往往較長，一般要持續(xù)30分鐘以上，這樣會對輻照部位產(chǎn)生更大的危害，為了提高照片清晰度，往往會采取提高聲強的手段，清晰度提高了，造成胎兒畸形的可能性也相應(yīng)增加了.美國醫(yī)用超聲波學(xué)會則警告說，雖然目前沒有超聲波引起缺陷的事例，但這種無人監(jiān)管的胎兒攝影持續(xù)下去，超聲波的強度和掃描次數(shù)增多，數(shù)年后可能造成不堪設(shè)想的后果.對這種新型超聲掃描方式國內(nèi)外學(xué)者對其在多大功率、多長時間上可造成機(jī)體的生物學(xué)損害尚未進(jìn)行研究，對胚胎胎兒安全與否至今仍無定論[1].因此,四維超聲檢查技術(shù)作用于胚胎后所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)及其危害做相應(yīng)的研究成為一項緊迫的任務(wù).

本實驗利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過四維超聲對小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)的影響，探討四維超聲波檢查作為產(chǎn)前例行檢查的必要性.為四維超聲在臨床上的安全應(yīng)用提供新的理論依據(jù).

1 資料與方法

1.1 動物模型分組及標(biāo)本采集

應(yīng)用成年雄性小鼠6只，成年雌性小鼠12只進(jìn)行交配，在懷孕的第16天時將孕鼠仰臥固定于木板上，然后涂抹耦合劑,用3維/4維探頭在孕鼠下腹部按既定時間進(jìn)行滑行掃查,（見左下鏡頭1）對照組進(jìn)行假輻照或不輻照，按照射時間不同隨機(jī)等分鐘為五組，I組（對照組）、II組（照射5分鐘組）、III組（照射10分鐘組）、IV組（照射20分鐘組）、V組（照射30分鐘組）每組3只.

1.2 儀器與方法

1.2.1 彩色超聲診斷儀（儀器采用GE公司730型）,使用三維/四維探頭,在中晚孕檢查預(yù)制條件下先用二維超聲引導(dǎo)選好掃查面，然后啟動四維體表模式進(jìn)行掃查，經(jīng)超聲功率計（美國UPLM-DT-1E）測定，彩超儀器的三維容積探頭在二維模式上平均I-SPTA（空間峰值時間平均強度）約為5.5mW/cm2，在三維模式上平均I-SPTA約為7.0mW/cm2，四維模式上平均I-SPTA約為6.0mW/cm2,檢查時均使用容積探頭.顯示器上的軟組織熱指數(shù)為0.2,機(jī)械指數(shù)為1.0.均符合我國國家標(biāo)準(zhǔn)（輸出聲束聲強小于20mW/cm2）.

四維超聲輻照后繼續(xù)喂養(yǎng)至出生10天,每窩隨機(jī)取兩只小鼠每組共六只.四只用于光鏡，兩只用于電鏡.2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.3m l/100mg），開胸，經(jīng)左心室插管，灌注生理鹽水，待沖靜血液后，灌注4%多聚甲醛溶液進(jìn)行全身固定.最后完整取出小鼠大腦放入4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24h以上，24小時后將固定好的組織塊經(jīng)常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋.冠狀切面連續(xù)切片，厚度為5μm.常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色采用過氧化酶標(biāo)記的鏈酶卵白素進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：切片常規(guī)脫蠟至水，0.01M PBS 清洗3次，每次5分鐘，0.3%甲醇-過氧化氫室溫下孵育20分鐘去除內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水清洗3次每次5分鐘，0.1M枸櫞酸緩沖液（pH6.0）微波爐內(nèi)修復(fù)，98℃維持20分鐘，冷卻至室溫.10%山羊血清37℃溫箱濕盒內(nèi)孵育10分鐘，濾紙吸去多余血清，加入一抗（鼠抗PCNA 1∶100稀釋），0.01M PBS清洗3次，每次5分鐘，滴加生物素化二抗（山羊抗鼠）工作液，37℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30分鐘，0.01M PBS清洗3次，每次5分鐘，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30分鐘，0.01M PBS清洗3次，每次5分鐘，DAB顯色2-5分鐘，自來水充分鐘沖洗，終止顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固.陰性對照用PBS替代一抗，其余步驟同上.

1.2.2 透射電鏡下:每組欲留電鏡標(biāo)本的2只實驗動物用Karnovsky's固定液灌流，（方法同光鏡標(biāo)本之灌流方法）然后將所取電鏡大腦皮層標(biāo)本切成約1mm的小塊，浸入Karnovsky's液中固定.包埋前經(jīng)0.1M PBS充分鐘沖洗，1%四氧化鋨后固定2h，0.1M PBS充分鐘沖洗，梯度酒精逐級脫水每次20分鐘，100%酒精∶丙酮（1:1）n浸透30分鐘，純丙酮浸透30分鐘，丙酮∶樹脂（1∶1）混合液溫箱過夜，純樹脂（815、812混合液）浸透 8h，樹脂包埋，37℃1天，60℃兩天使之聚合，Leica超薄切片機(jī)切片厚度50nm，切片用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色.日立H-7500型透射電子顯微鏡觀察，加速電壓100KV，10000倍照相.

1.2.3 組織學(xué)觀察及統(tǒng)計分析：光學(xué)顯微鏡下觀察組織學(xué)變化，400倍同樣放大倍數(shù)下進(jìn)行圖象分析并拍照.計量資料數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用方差分析，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)檢查

正常對照組如圖1所示：小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，胞漿內(nèi)有嗜堿性顆粒；細(xì)胞核圓形著色淺、核仁清晰.照射組：照射5分鐘、10分鐘、20分鐘組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與正常對照組無明顯區(qū)別.照射30分鐘組形態(tài)學(xué)觀察發(fā)生變化，如圖2所示：神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂；部分鐘細(xì)胞腫脹變大，胞核形狀不規(guī)則偏于一側(cè)、胞漿著色不均勻呈空泡狀、尼氏體減少；并有部分鐘神經(jīng)細(xì)胞收縮壞死、呈嗜酸性、核不清楚.在光學(xué)顯微鏡下證明該小鼠的神經(jīng)細(xì)胞在照射30分鐘后從形態(tài)上開始發(fā)生變化.

圖1 正常組HE染色（200×）

圖2 照射30分鐘組HE染色（200×）

2.2 PCNA在大腦皮層的表達(dá)結(jié)果

PCNA陽性顆粒呈棕黃色位于細(xì)胞核內(nèi)，正常對照組如圖3所示，棕黃色細(xì)胞核個數(shù)多.隨照射時間的延長棕黃色細(xì)胞核個數(shù)逐漸減少，照射30分鐘組如圖4所示，棕黃色細(xì)胞核個數(shù)明顯減少.

圖3 正常組PCNA免疫組化染色（400×）

圖4 照射30分鐘組PCNA免疫組化染色（400×）

2.3 PCNA在大腦皮層的定量表達(dá)

計算單位面積內(nèi)PCNA陽性細(xì)胞數(shù)并求其均值：結(jié)果顯示照射10分鐘、20分鐘、30分鐘組與對照組相比PCNA陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)明顯減少，顯示兩組間有顯著性差異（P<0.01）.各組之間比較見表1.

表1 照射時間對小鼠大腦皮層核增殖抗原的影響（x±s）

照射時間對小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞核增殖抗原的影響

2.4 透射電鏡染色結(jié)果

正常對照組如圖5所示：神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核呈規(guī)則圓形，核仁清楚，常染色質(zhì)分布均勻.照射組：照射10分鐘、20分鐘、30分鐘組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)都有變化，并且隨著照射時間延長愈發(fā)嚴(yán)重.如圖6所示主要表現(xiàn)為：①細(xì)胞核染色質(zhì)分布不均，成團(tuán)塊狀濃縮或邊聚；②核周腔增大、變寬；③核周質(zhì)(胞質(zhì))內(nèi)糖原與游離核糖體稀疏；④大部分線粒體腫脹呈空泡化.電鏡下進(jìn)一步證實四維超聲照射對小鼠中樞神經(jīng)細(xì)胞損害，神經(jīng)細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，并隨時間的進(jìn)展而加重.結(jié)論：超聲掃描檢查5分鐘后，胎兒大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)開始有變性改變，30分鐘組胎兒大腦皮質(zhì)細(xì)胞變性改變更為明顯.

圖5 正常組電鏡下染色（10000×）

圖6 照射30分鐘組電鏡下染色（10000×）

3 討論

四維超聲的發(fā)射原理和傳統(tǒng)的2D超聲相同，四維超聲是邊掃描邊顯示，是一種時實立體顯像技術(shù)，只要掃描不中斷便會連續(xù)向機(jī)體發(fā)射超聲.超聲波在生物體內(nèi)傳播時，通過組織間的相互作用，導(dǎo)致生物體機(jī)能和結(jié)構(gòu)變化，稱為超聲波的生物效應(yīng)，產(chǎn)生生物效應(yīng)的機(jī)制是熱效應(yīng)和空化效應(yīng).所謂的熱效應(yīng)是指超聲波傳播過程中，部分能量被生物組織吸收轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮埽菇M織溫度增高；空化效應(yīng)是指超聲波傳播過程中與組織中的氣核或微氣泡相互作用，使其突然爆破，產(chǎn)生巨大的瞬間壓力，使組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變.一般認(rèn)為由于在胎兒體內(nèi)不存在空氣—水界面，空化效應(yīng)不會出現(xiàn)，而熱效應(yīng)在動物實驗中顯示是致畸形因素[2].陳光陽等通過觀察診斷級超聲波對活鼠胚胎心肌細(xì)胞Bcl-2及Bax表達(dá)及其凋亡的影響.認(rèn)為較高強度在該過程中診斷級超聲波長時間輻射可導(dǎo)致胎鼠心肌細(xì)胞凋亡[3].

細(xì)胞凋亡也稱程序性細(xì)胞死亡，是指生理和病理情況下，細(xì)胞由各種因素調(diào)控所引起的一組形態(tài)和生化特征明確的細(xì)胞主動死亡形式.其特征為：細(xì)胞皺縮，核固縮，染色質(zhì)濃集，細(xì)胞膜內(nèi)陷，將細(xì)胞自行分割成被細(xì)胞膜包裹的凋亡小體，最后被周圍的巨噬細(xì)胞吞噬.整個過程中，細(xì)胞內(nèi)容物不外泄，故不引起炎癥反應(yīng).凋亡明顯區(qū)別于被動性死亡、壞死[4,5].

增殖細(xì)胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是一個36KD酸性核蛋白，PCNA的表達(dá)越高說明DNA復(fù)制活躍程度增加，它是反映細(xì)胞增生的一項重要指標(biāo)，PCNA表達(dá)水平是細(xì)胞增殖狀態(tài)的標(biāo)志.

本試驗結(jié)果組織病理學(xué)顯示超聲掃描檢查5分鐘后，胎兒大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)開始有變性改變，在光學(xué)顯微鏡下證明該小鼠的神經(jīng)細(xì)胞在照射30分鐘后胎兒大腦皮質(zhì)細(xì)胞變性改變更為明顯.PCNA在大腦皮層的表達(dá)，隨照射時間的延長棕黃色細(xì)胞核個數(shù)逐漸減少，照射30分鐘，棕黃色細(xì)胞核個數(shù)明顯減少.PCNA在大腦皮層的定量表達(dá)顯示照射10分鐘、20分鐘、30分鐘組與對照組相比PCNA陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)明顯減少，表明四維超聲照射后中樞神經(jīng)細(xì)胞PCNA表達(dá)減少.透射電鏡染色電鏡下進(jìn)一步證實四維超聲照射對小鼠中樞神經(jīng)細(xì)胞損害，神經(jīng)細(xì)胞開始出現(xiàn)腫脹和凋亡現(xiàn)象，并隨時間的進(jìn)展而加重.30分鐘組胎兒大腦皮質(zhì)細(xì)胞變性改變更為明顯.綜上說明四維超聲照射對胎鼠中樞神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)成一定的刺激.它可抑制神經(jīng)細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，進(jìn)一步推斷可能引起中樞學(xué)習(xí)記憶功能障礙.因此四維超聲波檢查作為產(chǎn)前例行檢查，在掃描功率及時間上應(yīng)密切注意，以盡量減少對胎兒的損傷.

〔1〕Znsman I,Reifen R,Livni O.Role of apoptosis,proliferating cell nuclear antigen and p53 protein in chem ically induced colon cancer in rats fed corncob fiber treated w ith the fungus pleurotus ostreatus.Anticancer Res.1997,17(3c):2105-2113（PCNA）.

〔2〕夏國園，蘇巧榮.診斷級超聲對活鼠胚胎生物學(xué)效應(yīng)的研究進(jìn)展[J].實用放射學(xué)雜志，2004，20(6):554-555.

〔3〕陳光陽.超聲波對活鼠胚胎心肌細(xì)胞凋亡影響的研究[J].中國輻射衛(wèi)生，2007,16（3）.

〔4〕趙品，段云友.晚孕期彩超重復(fù)照射對胎鼠中樞神經(jīng)P53蛋白表達(dá)及超微結(jié)構(gòu)的影響 [J].中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2005，21（8):1169-1170.

〔5〕程顏苓，段云友,田蓉.超聲輻照后胎鼠腦Fos蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].中華超聲影像學(xué)雜志，2003，12（4）.