水產(chǎn)品免疫組化研究

摘 要：本文主要對(duì)免疫組化操作中的幾個(gè)重要的環(huán)節(jié)，從取材固定、脫蠟、抗原修復(fù)、抗體的使用及顯色等環(huán)節(jié)分別介紹了一些個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)，希望對(duì)從事相同工作的同行有所幫助。

關(guān)鍵詞：免疫組化；水產(chǎn)品；分析

中圖分類號(hào)：F40 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

隨著免疫組化技術(shù)在臨床病理診斷中的不斷深入和廣泛應(yīng)用，我們也在試圖將它運(yùn)用到更多領(lǐng)域的研究中，本文作者主要從事的就是水產(chǎn)動(dòng)物內(nèi)源性蛋白酶的免疫組化研究。由于免疫組化技術(shù)是一個(gè)復(fù)雜的生物技術(shù)，實(shí)驗(yàn)操作步驟也較繁瑣，諸多的因素都可以影響到最終的染色結(jié)果，其中只要一步有問(wèn)題就會(huì)影響最終結(jié)果的判定。筆者結(jié)合從事免疫組化研究以來(lái)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)談一下關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物免疫組化的經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)，希望能對(duì)從事相同研究的同行有所幫助。

1 做免疫組化載玻片的準(zhǔn)備

選用高質(zhì)量的玻璃片作為免疫組化的載玻片，載玻片在使用前一定要用強(qiáng)酸洗液進(jìn)行浸泡，之后用大量的蒸餾水沖洗干凈，再用無(wú)水乙醇清洗一遍，之后用雙蒸水沖洗干凈，烘干后要經(jīng)APES處理后使用，這樣可以防止后續(xù)的處理過(guò)程中組織切片的脫落。載玻片的處理也是免疫組化中較為基礎(chǔ)的一步，如果處理不好，最后的組織切片上會(huì)有黑點(diǎn)或其他不干凈的東西，從而影響最終免疫組化染色切片的質(zhì)量。

2 組織的取材和固定

組織的取材要根據(jù)自己的實(shí)際需要自行決定，不宜過(guò)大或者過(guò)小，因?yàn)槊庖呓M化后續(xù)的處理過(guò)程中有高溫加熱抗原修復(fù)的步驟，所以組織取材不宜過(guò)大，約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm較為適宜，否則后續(xù)處理中組織塊很容易脫落，造成后續(xù)的染色步驟無(wú)法正常進(jìn)行；但是取材也不宜過(guò)小，否則顯微鏡下視野太小，不利于結(jié)果的判定。取材后的組織要及時(shí)的進(jìn)行固定，同時(shí)還要選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ海潭ㄒ旱臐舛群蚿H值也要把握好，我們一般選用的是10%的中性甲醛作為固定液，不恰當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簼舛葧?huì)使組織的抗原性降低甚至消失，從而影響抗原的表達(dá)，導(dǎo)致檢測(cè)不到陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)，固定時(shí)間也要掌握好，時(shí)間的長(zhǎng)短也會(huì)影響組織的抗原性。此外，固定不當(dāng)還會(huì)影響到組織細(xì)胞的通透性，不利于后續(xù)染色中抗體的進(jìn)入，適宜的固定時(shí)間一般是12-24小時(shí)。固定過(guò)程中還要確保組織塊都浸沒(méi)在固定液中。

3 石蠟切片的脫蠟處理

要想得到一張高質(zhì)量的免疫組化染色切片，脫蠟處理也是其中較為關(guān)鍵和基礎(chǔ)的一步。首先要在60℃下進(jìn)行烤片30min，使石蠟融化，然后迅速放入60℃預(yù)熱的二甲苯中，但是實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，有時(shí)在規(guī)定的溫度和時(shí)間條件下，石蠟并不能很好的融化，此時(shí)要延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間或適當(dāng)提高烤片溫度，使石蠟?zāi)芎芎玫娜诨颐撓灥男Ч褪覝匾灿泻艽蟮年P(guān)系，冬天脫蠟時(shí)間相對(duì)就要長(zhǎng)些，而夏天就可以適當(dāng)短些。脫蠟后的組織切片如果發(fā)白，則說(shuō)明脫蠟不徹底，這樣會(huì)造成最終的免疫組化染色結(jié)果的背景過(guò)深，非特異性染色嚴(yán)重，影響結(jié)果的判定。

4 抗原修復(fù)

在免疫組化操作的整個(gè)過(guò)程中，抗原修復(fù)是其中一個(gè)極其關(guān)鍵的步驟，它的好與壞直接影響到最終結(jié)果的可靠性和真實(shí)性。由于組織經(jīng)過(guò)中性甲醛或其他固定液固定和石蠟包埋后，組織內(nèi)部的氨基酸殘基容易形成分子內(nèi)或分子間的醛鍵，使得抗原決定簇被封閉，抗原與抗體的結(jié)合位點(diǎn)減少，從而使抗原的陽(yáng)性檢測(cè)率及著色強(qiáng)度相對(duì)減弱。

抗原修復(fù)就是采用加熱修復(fù)或高溫高壓的方式打破抗原決定簇之間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，使抗原決定簇重新暴露出來(lái)，以便更好的和抗體進(jìn)行結(jié)合，從而提高免疫組化染色結(jié)果的陽(yáng)性率。一般采用的是加0.01M，pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液，微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，但是微波火力要控制好，否則容易造成組織切片的破碎和脫落。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，對(duì)于含肌原纖維較多的水產(chǎn)動(dòng)物組織來(lái)說(shuō)，微波火力可以適當(dāng)高些，用中高火20～30 min即可，組織切片還可以保存的較完整；但是對(duì)于含膠原纖維較多的水產(chǎn)動(dòng)物組織來(lái)說(shuō)，由于組織比較脆弱，所以微波火力要適當(dāng)降低，即先用中高火加熱至微沸，之后要改用中火或中低火，時(shí)間也要減短，大概10-15 min即可。需要注意的是，加熱過(guò)程中溶液不可沸騰，發(fā)現(xiàn)液體里有大量氣泡產(chǎn)生應(yīng)立即停止加熱，稍冷片刻再繼續(xù)加熱。

5 抗體的稀釋和保存

對(duì)于每一批新進(jìn)的抗體，都應(yīng)該按照廠家提供的建議稀釋度，進(jìn)行成倍稀釋的預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果廠家建議稀釋度為1：50～1：100，那實(shí)驗(yàn)就要進(jìn)行1：20，1：50，1：100，1：200的梯度實(shí)驗(yàn)，最終確定實(shí)驗(yàn)應(yīng)選用的最適濃度。抗體的稀釋要選用組織切片各步的清洗中的所用緩沖液進(jìn)行稀釋，而且要保持pH值的穩(wěn)定，這樣可以使抗體處于一種緩沖的狀態(tài)中，更有利于抗原抗體的結(jié)合。抗體最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋后的抗體最好一次用完，而且不能反復(fù)凍融，因?yàn)檫@樣會(huì)使抗體的效價(jià)降低，影響最終的免疫組化染色結(jié)果。

6 DAB顯色

DAB顯色劑的濃度和顯色時(shí)間也是影響免疫組化染色結(jié)果的一個(gè)很重要的因素，濃度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)使組織切片的背景加深，甚至造成假陽(yáng)性結(jié)果。顯色不宜過(guò)快或過(guò)慢，一般以5-10min為宜。顯色時(shí)間太短（如幾秒或幾十秒），很可能說(shuō)明抗體濃度過(guò)高或者抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要下調(diào)抗體濃度或縮短孵育時(shí)間，也可能是前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(zhǎng)封閉時(shí)間；顯色時(shí)間太長(zhǎng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現(xiàn)陽(yáng)性染色，說(shuō)明抗體濃度太低或孵育時(shí)間太短，也可能是封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

DAB顯色劑最好也是現(xiàn)用現(xiàn)配，稀釋用的緩沖液要在4℃進(jìn)行存放，而溶液A和溶液C要在-20℃避光保存，現(xiàn)配的DAB顯色劑應(yīng)該為無(wú)色或淺棕色，如果顏色過(guò)深，就不可以再使用了，應(yīng)重新配制或檢查藥品是否存放不當(dāng)或者是否過(guò)期等。

結(jié)語(yǔ)

綜上所述，免疫組化操作雖然步驟繁多，其中的影響因素也較多，但是只要把握好以上幾點(diǎn)，出現(xiàn)問(wèn)題能夠及時(shí)有效的解決，就可以做出一張背景清晰，結(jié)構(gòu)完整的免疫組化切片。

參考文獻(xiàn)

[1]倪燦榮，馬大烈，戴益民.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用[M].上海：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[2]趙燕燕.免疫組化技術(shù)在小鼠組織中的應(yīng)用[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2010，19（06）：34-35.

[3]蔡文琴，王伯.實(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)與核酸分子雜交技術(shù)[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1994：1-20