水產品免疫組化研究

摘 要：本文主要對免疫組化操作中的幾個重要的環節，從取材固定、脫蠟、抗原修復、抗體的使用及顯色等環節分別介紹了一些個人的經驗和體會，希望對從事相同工作的同行有所幫助。

關鍵詞：免疫組化；水產品；分析

中圖分類號：F40 文獻標識碼：A

隨著免疫組化技術在臨床病理診斷中的不斷深入和廣泛應用，我們也在試圖將它運用到更多領域的研究中，本文作者主要從事的就是水產動物內源性蛋白酶的免疫組化研究。由于免疫組化技術是一個復雜的生物技術，實驗操作步驟也較繁瑣，諸多的因素都可以影響到最終的染色結果，其中只要一步有問題就會影響最終結果的判定。筆者結合從事免疫組化研究以來的實踐經驗談一下關于水產動物免疫組化的經驗和體會，希望能對從事相同研究的同行有所幫助。

1 做免疫組化載玻片的準備

選用高質量的玻璃片作為免疫組化的載玻片，載玻片在使用前一定要用強酸洗液進行浸泡，之后用大量的蒸餾水沖洗干凈，再用無水乙醇清洗一遍，之后用雙蒸水沖洗干凈，烘干后要經APES處理后使用，這樣可以防止后續的處理過程中組織切片的脫落。載玻片的處理也是免疫組化中較為基礎的一步，如果處理不好，最后的組織切片上會有黑點或其他不干凈的東西，從而影響最終免疫組化染色切片的質量。

2 組織的取材和固定

組織的取材要根據自己的實際需要自行決定，不宜過大或者過小，因為免疫組化后續的處理過程中有高溫加熱抗原修復的步驟，所以組織取材不宜過大，約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm較為適宜，否則后續處理中組織塊很容易脫落，造成后續的染色步驟無法正常進行；但是取材也不宜過小，否則顯微鏡下視野太小，不利于結果的判定。取材后的組織要及時的進行固定，同時還要選擇適當的固定液，固定液的濃度和pH值也要把握好，我們一般選用的是10%的中性甲醛作為固定液，不恰當的固定液濃度會使組織的抗原性降低甚至消失，從而影響抗原的表達，導致檢測不到陽性結果。同時，固定時間也要掌握好，時間的長短也會影響組織的抗原性。此外，固定不當還會影響到組織細胞的通透性，不利于后續染色中抗體的進入，適宜的固定時間一般是12-24小時。固定過程中還要確保組織塊都浸沒在固定液中。

3 石蠟切片的脫蠟處理

要想得到一張高質量的免疫組化染色切片，脫蠟處理也是其中較為關鍵和基礎的一步。首先要在60℃下進行烤片30min，使石蠟融化，然后迅速放入60℃預熱的二甲苯中，但是實踐經驗表明，有時在規定的溫度和時間條件下，石蠟并不能很好的融化，此時要延長脫蠟時間或適當提高烤片溫度，使石蠟能很好的融化，而且脫蠟的效果和室溫也有很大的關系，冬天脫蠟時間相對就要長些，而夏天就可以適當短些。脫蠟后的組織切片如果發白，則說明脫蠟不徹底，這樣會造成最終的免疫組化染色結果的背景過深，非特異性染色嚴重，影響結果的判定。

4 抗原修復

在免疫組化操作的整個過程中，抗原修復是其中一個極其關鍵的步驟，它的好與壞直接影響到最終結果的可靠性和真實性。由于組織經過中性甲醛或其他固定液固定和石蠟包埋后，組織內部的氨基酸殘基容易形成分子內或分子間的醛鍵，使得抗原決定簇被封閉，抗原與抗體的結合位點減少，從而使抗原的陽性檢測率及著色強度相對減弱。

抗原修復就是采用加熱修復或高溫高壓的方式打破抗原決定簇之間的交聯結構，使抗原決定簇重新暴露出來，以便更好的和抗體進行結合，從而提高免疫組化染色結果的陽性率。一般采用的是加0.01M，pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液，微波爐內進行抗原修復，但是微波火力要控制好，否則容易造成組織切片的破碎和脫落。個人經驗認為，對于含肌原纖維較多的水產動物組織來說，微波火力可以適當高些，用中高火20～30 min即可，組織切片還可以保存的較完整；但是對于含膠原纖維較多的水產動物組織來說，由于組織比較脆弱，所以微波火力要適當降低，即先用中高火加熱至微沸，之后要改用中火或中低火，時間也要減短，大概10-15 min即可。需要注意的是，加熱過程中溶液不可沸騰，發現液體里有大量氣泡產生應立即停止加熱，稍冷片刻再繼續加熱。

5 抗體的稀釋和保存

對于每一批新進的抗體，都應該按照廠家提供的建議稀釋度，進行成倍稀釋的預實驗，如果廠家建議稀釋度為1：50～1：100，那實驗就要進行1：20，1：50，1：100，1：200的梯度實驗，最終確定實驗應選用的最適濃度。抗體的稀釋要選用組織切片各步的清洗中的所用緩沖液進行稀釋，而且要保持pH值的穩定，這樣可以使抗體處于一種緩沖的狀態中，更有利于抗原抗體的結合。抗體最好是現用現配，稀釋后的抗體最好一次用完，而且不能反復凍融，因為這樣會使抗體的效價降低，影響最終的免疫組化染色結果。

6 DAB顯色

DAB顯色劑的濃度和顯色時間也是影響免疫組化染色結果的一個很重要的因素，濃度過高或時間過長都會使組織切片的背景加深，甚至造成假陽性結果。顯色不宜過快或過慢，一般以5-10min為宜。顯色時間太短（如幾秒或幾十秒），很可能說明抗體濃度過高或者抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短孵育時間，也可能是前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；顯色時間太長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，說明抗體濃度太低或孵育時間太短，也可能是封閉時間過長。

DAB顯色劑最好也是現用現配，稀釋用的緩沖液要在4℃進行存放，而溶液A和溶液C要在-20℃避光保存，現配的DAB顯色劑應該為無色或淺棕色，如果顏色過深，就不可以再使用了，應重新配制或檢查藥品是否存放不當或者是否過期等。

結語

綜上所述，免疫組化操作雖然步驟繁多，其中的影響因素也較多，但是只要把握好以上幾點，出現問題能夠及時有效的解決，就可以做出一張背景清晰，結構完整的免疫組化切片。

參考文獻

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