微流控芯片子宮

摘 要 由于體外環(huán)境對受精和胚胎發(fā)育的影響，現(xiàn)有人工輔助生殖技術(shù)存在受精成功率低和胎兒出生后風(fēng)險高的問題。針對上述問題，本研究發(fā)展了一種基于微流控芯片的人工子宮，其特色在于使用子宮內(nèi)膜細胞胚胎共培養(yǎng)機制，并以連續(xù)灌流方式實現(xiàn)細胞與外界物質(zhì)交換。實驗利用上述芯片完成了排卵、受精、著床以及胚胎發(fā)生等一系列過程。與傳統(tǒng)方法相比，芯片方法不僅操作簡便，而且可以獲得更高的桑椹胚率和囊胚率。 已經(jīng)取得的研究結(jié)果顯示，這種芯片子宮有希望發(fā)展成人工輔助生殖的有力工具。

關(guān)鍵詞 微流控芯片； 子宮； 共培養(yǎng)； 受精； 胚胎

輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用使得不育夫婦得以實現(xiàn)妊娠生子的愿望，由不育引發(fā)的相關(guān)問題也隨之得到解決。體外受精胚胎移植（In vitro fertilizationembryo transplantation， IVFET），即試管嬰兒，是輔助生殖技術(shù)的重要內(nèi)容。該技術(shù)是指將從母體取出的卵子體外受精并發(fā)育成前期胚胎后移植回母體子宮內(nèi)，經(jīng)妊娠后分娩嬰兒＼[1，2＼]。歷經(jīng)60余年的發(fā)展，IVFET已經(jīng)得到廣泛推廣并成為治療不孕癥的主要手段。盡管IVFET取得了巨大成功，該技術(shù)仍存在許多不足，其中最突出的問題包括妊娠率低、多胎妊娠發(fā)生率明顯增高和出生后缺陷風(fēng)險增高＼[3＼]。究其原因，主要是由于現(xiàn)有細胞培養(yǎng)技術(shù)不能有效模擬體內(nèi)條件，因而影響了胚胎質(zhì)量。因此，現(xiàn)實醫(yī)療工作中迫切需要一種能夠模擬子宮環(huán)境，保證高質(zhì)量受精和胚胎發(fā)育的細胞培養(yǎng)技術(shù)。

微流控芯片是組織、器官仿真的有力工具＼[4～9＼]。一方面，微流控通道具有與體內(nèi)微血管相似的尺寸，在這個尺度下流體所具有的層流特性便于實現(xiàn)精確的流體控制；另一方面，通過芯片材料和芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計，可以有效模擬組織或器官的結(jié)構(gòu)和功能。前期研究報導(dǎo)了一系列基于微流控芯片的精子分選、受精以及胚胎發(fā)育等單元操作技術(shù)＼[10～13＼]。在這些工作基礎(chǔ)上，微流控芯片技術(shù)有望實現(xiàn)子宮的整體功能以促進胚胎發(fā)育和提高胚胎質(zhì)量＼[14，15＼]。本工作設(shè)計了一種微流控芯片子宮，保證在類似子宮內(nèi)部的環(huán)境下實現(xiàn)排卵、受精和胚胎發(fā)生。初步結(jié)果顯示，芯片子宮較之傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)平臺可以獲得更高的桑椹胚率和囊胚率。

2 實驗部分

2.1 實驗材料

細胞呈像使用倒置熒光顯微鏡（IX71， Olympus）；TS2A四通道獨立可控式微量注射泵（保定蘭格）；聚碳酸酯（Polycarbonate，PC）薄膜（8 μm 濾孔，英國Whatman公司）；SU8 3025光刻膠（美國MicroChem公司）。聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）前體及引發(fā)劑，30 mm培養(yǎng)皿（美國Dow Corning公司）。3氨丙基三乙氧基硅烷（3aminopropyl triethoxysilan， APTES）、PBS 、M16培養(yǎng)基、明膠及透明質(zhì)酸酶（美國Sigma公司）。礦物油、二甲基亞砜（上海生工（上海）有限公司）。CellTracker Green和CellTracker Red（美國Life Technologies公司）。成年昆明小鼠購自廣東省動物實驗中心； 小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞、子宮內(nèi)膜上皮細胞培養(yǎng)基購自中國齊氏生物科技有限公司。孕馬血清促性腺激素（Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotrophin，HCG）購自杭州動物藥品廠。精子洗液PureSperm Wash（瑞典Nidacon international AB公司）。實驗用水為二次蒸餾水。

分 析 化 學(xué)第41卷第4期李偉萱等： 微流控芯片子宮 2.2 芯片結(jié)構(gòu)與加工

芯片包含3層結(jié)構(gòu)，頂層和底層為PDMS而中間層為多孔PC膜（圖1a）。PDMS層采用標(biāo)準(zhǔn)軟刻蝕工藝＼[16＼]加工。首先在平板玻璃上完成SU8模板的制作。取直徑為3英寸的玻璃置于濃H2SO4H2O2（3 ∶ 1， V/V）中煮沸30 min，取出后用蒸餾水沖洗3次，并在蒸餾水中超聲清洗2次，每次30 min。超聲后的玻璃用氮氣吹干，備用。將潔凈玻璃置于勻膠臺，向其中心處滴加SU8 3025光刻膠，勻膠機轉(zhuǎn)速為600 r/min，持續(xù)30 s，升高轉(zhuǎn)速至1000 r/min，再持續(xù)30 s。鋪膠后的玻璃置于烘膠臺上進行前烘，95 ℃烘15 min。待玻璃自然冷卻后，用掩膜覆蓋玻璃表面的SU8膠層，置于紫外光刻機下曝光20 s。曝光后立刻將玻璃置于烘膠臺上95 ℃烘15 min。待玻璃自然冷卻后將其置于顯影液中，輕輕震蕩進行顯影，之后用電吹風(fēng)將其吹干。最后，將模板置于175 ℃烘箱中烘1 h，進行堅模以得到SU8模板。將Sylgard184單體與引發(fā)劑按體積比10：1混合均勻，導(dǎo)入SU8模板，將模板置于真空氣缸內(nèi)真空脫氣。脫氣后置于80 ℃烘箱固化1 h，自然冷卻后將PDMS從模板上剝離，剝離后在入口和出口處打孔。芯片頂層含有寬500 μm，高110 μm蜿蜒形通道，通道中交錯分布一系列用于捕獲卵細胞的弧形篩網(wǎng)，篩網(wǎng)直徑150 μm，由6根直徑35 μm的微柱圍成。芯片底層含有4個平行的矩形通道（6 mm×3 mm×110 μm），兩端與共同的入口和出口連接。通道底面具有4×3微柱陣列用于支撐PC膜。PC膜處理按照文獻＼[17＼]的方法，將PDMS層等離子處理后與APTES處理的PC膜封接，步驟如下：①將需要封接的PDMS及PC膜 表面氧等離子處理1 min；②等離子處理后的PC膜浸泡于5% APTES溶液中20 min；③將PC膜取出，用蒸餾水沖洗3次，以去除表面未結(jié)合的APTES，氮氣吹干薄膜；④將PDMS與PC膜

2.3 生殖細胞和子宮內(nèi)膜細胞的準(zhǔn)備

IVF公鼠的選擇、取精與精子處理＼[18＼]，具體方法：選擇8 周齡以上、體重大于 25 g、雄性特征明顯的公鼠，頸部脫臼致死， 剖開腹部取出附睪及輸精管， 用小鑷子擠壓附睪尾部使精子擠入1 mL 平衡過夜的精子洗液滴中， 去掉附睪組織， 將此液滴置于 37 ℃、5 % CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)20～25 min， 使精子自由浮動。精子獲能操作參考精子洗液試劑盒說明書進行，具體方法：取10 μL上述初步孵育、分散較好的活躍精子懸浮液加入到 50 μL平衡過夜的精子洗液滴中， 用血細胞計數(shù)器計算精子濃度并調(diào)整至 2×105～5 ×105 個/mL， 將此精子懸浮液置于 37 ℃、5 % CO2和飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng) 2 h。

IVF母鼠的選擇與處理參考文獻＼[19，20＼]，具體方法：選擇6周齡以上、體重大于20 g的健康母鼠， 每只母鼠腹腔注射10 IU PMSG， 間隔48 h后再注射10 IU HCG， 間隔 13～17 h待用。將上述處理的母鼠于注射 HCG后 13～17 h， 取其輸卵管置于1 mL卵細胞洗滌液中， 自輸卵管壺腹部取出成熟卵冠丘復(fù)合體（Oocytecoronacumulus complex， OCCC），用 0.3 %透明質(zhì)酸酶溶液處理去除卵丘細胞， 再用50 μL洗滌液沖洗4 次， 得到成熟裸卵。

小鼠子宮內(nèi)膜細胞在培養(yǎng)瓶中進入指數(shù)生長期后收獲并制成密度為2×105/mL的細胞懸液備用。

2.4 芯片實驗操作

芯片和聚四氟乙烯毛細管在使用之前80 ℃烘烤1 h，微量注射器在75%乙醇中浸泡6 h后用滅菌蒸餾水沖3 次。使用前芯片、毛細管和注射器均置于紫外燈下照射，使用時在超凈工作臺上將芯片與注射器通過毛細管連接。明膠用滅菌雙蒸水配制成0.5%的溶液。部分實驗中使用CellTracker Green標(biāo)記小鼠子宮內(nèi)膜細胞，以CellTracker Red標(biāo)記卵細胞。CellTracker工作液使用二甲基亞砜新鮮配置。細胞標(biāo)記步驟如下：①收集細胞懸液后離心，吸取上清液，加入CellTracker染液于細胞懸液中至終濃度10 μmol/L，37℃孵育30 min；②將細胞離心，棄上清后加入PBS緩沖液，37 ℃孵育10 min；③再次離心并加入PBS緩沖液洗滌細胞，目的在于清除未結(jié)合染料。用CellTracker Green標(biāo)記細胞在熒光顯微鏡下觀察時用藍光激發(fā)觀察，而CellTracker Red標(biāo)記細胞用綠光激發(fā)觀察。

芯片操作步驟如圖2所示：（a）芯片通道出入口1， 4開放，2， 3關(guān)閉。操作前先用0.5%明膠溶液灌注芯片通道2 min。微量注射泵抽取20 mL子宮內(nèi)膜細胞懸液從芯片進樣通道緩慢注入，該步驟使子宮內(nèi)膜細胞沉積在上層通道的卵細胞捕獲區(qū)。排出剩余細胞懸液后芯片靜置于培養(yǎng)箱中靜置8 h后，用齊氏實驗室配制的子宮內(nèi)膜培養(yǎng)基以10 μL/h流速灌流培養(yǎng)； （b）培養(yǎng)小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞24 h后，芯片通道出入口1， 2開放，3， 4關(guān)閉，以10 μL/h流速引入小鼠卵細胞懸液以將卵細胞其捕獲于微篩網(wǎng)中；（c）繼而以10 μL/h流速向通道引入獲能精子，保留6 h完成受精； （d） 芯片通道出入口3， 4開放，1，2關(guān)閉，以10 μL/h速度持續(xù)灌流M16胚胎培養(yǎng)液。實驗期間每隔24 h在倒置顯微鏡下觀察芯片中胚胎的發(fā)育情況并拍照記錄。

2.5 芯片與傳統(tǒng)方法對照實驗

對照實驗中，在直徑30 mm的培養(yǎng)皿中加入胚胎培養(yǎng)液M16 100 μL，覆蓋礦物油。每個液滴中約含5個卵細胞。加入獲能的精子，受精后把受精卵移到新的培養(yǎng)液滴中，每24 h更換一次培養(yǎng)液，直到受精卵發(fā)育成囊胚。

芯片組的卵細胞樣本總數(shù)為292，對照組卵細胞樣本總數(shù)為295。比較芯片方法與傳統(tǒng)方法在受精率、4細胞率、桑葚胚率和囊胚率方面的差別。其中，受精率、4細胞率、桑葚胚率和囊胚率分別為發(fā)育成2細胞體、4細胞體、16細胞體和32細胞體的受精卵占卵細胞總數(shù)的百分比。兩組實驗數(shù)據(jù)差異顯著性用t檢驗分析。3 結(jié)果與討論

3.1 微流控芯片設(shè)計

本研究借助微流控芯片細致模擬子宮的結(jié)構(gòu)與功能，保證受精和胚胎發(fā)生過程在類似體內(nèi)環(huán)境下完成。子宮腔內(nèi)襯子宮內(nèi)膜，是直接與受精卵/胚胎接觸的部分。為模擬上述結(jié)構(gòu)，研究設(shè)計了一種多層微流控芯片，其特色在于以多孔薄膜材料支撐子宮內(nèi)膜細胞生長，模擬子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)（圖1b）。實驗選用孔徑為8 μm的PC濾膜，一方面可以截留子宮內(nèi)膜細胞，另一方面可以作為細胞培養(yǎng)的支撐并允許培養(yǎng)液經(jīng)由濾孔擴散為細胞及受精卵提供養(yǎng)分。子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)區(qū)的微篩網(wǎng)結(jié)構(gòu)可以實現(xiàn)卵細胞定位捕獲，這樣就模擬體內(nèi)微環(huán)境建立了卵細胞/胚胎子宮內(nèi)膜細胞共培養(yǎng)體系（見圖2）。此外，結(jié)合芯片內(nèi)部設(shè)計與外部控制，將卵細胞定位、受精和胚胎形成在芯片上集成，可以盡量減少外界對細胞的干擾。

3.3 芯片子宮內(nèi)的受精及著床

卵細胞培養(yǎng)24～48 h后，向芯片引入獲能的小鼠精子模擬受精過程。少量精子接觸卵細胞后與其結(jié)合，約6 h后完成受精。受精后繼續(xù)灌流培養(yǎng)，培養(yǎng)液一方面為受精卵不斷補充新的營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面可以及時排除代謝廢物。受精后約12 h后能觀察到小鼠精卵細胞結(jié)合。受精卵經(jīng)過連續(xù)多次分裂之后在4 d內(nèi)形成桑椹胚（16細胞），后者在芯片通道內(nèi)繼續(xù)分裂形成囊胚（32細胞），大約在受精后6～8 d進入子宮內(nèi)膜層完成著床（見圖4）。

實驗比較了芯片子宮與傳統(tǒng)方法獲得的2細胞率、4細胞率、桑椹胚率和囊胚率，這些指標(biāo)可以動態(tài)地反映胚胎生成狀況。在離體培養(yǎng)哺乳類動物（包括人）受精卵時發(fā)現(xiàn)，在一些化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中受精卵往往不能發(fā)育到囊胚，而是停頓在某個特定的發(fā)育時期，這種現(xiàn)象被稱作“發(fā)育阻斷”。“發(fā)育阻斷”發(fā)生的具體機制尚不明了，分析可能是由于體外環(huán)境中存在不利于胚胎生成的因素。為了克服胚胎體外發(fā)育阻斷，實驗在芯片上采用卵細胞與子宮內(nèi)膜細胞灌流共同培養(yǎng)方法，提供高度仿真的微環(huán)境以促進胚胎發(fā)育。 圖5 芯片子宮與傳統(tǒng)培養(yǎng)皿中胚胎形成的比較

Fig.5 Comparison of embryo development in petri dish and microfluidic uterus

*： p<0.05， difference is significent compared with the controlgroup.

結(jié)果顯示，培養(yǎng)皿組的2細胞體，4細胞體，桑椹胚以及囊胚數(shù)目分別為202，149，128和73，而芯片組的對應(yīng)數(shù)值為206，200，159和122。芯片組受精卵各時期地發(fā)育情況均優(yōu)于培養(yǎng)皿組 （圖5）。雖然兩組的受精情況（2細胞率）大致相當(dāng)，但在胚胎逐漸發(fā)育的過程中體現(xiàn)出明顯差異。結(jié)果表明，芯片組桑椹胚率和囊胚率明顯高于培養(yǎng)皿對照組，以囊胚率的提高最為顯著。相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿方法，本研究發(fā)展的芯片子宮方法更有利于提高受精率及囊胚率。與單純的卵細胞培養(yǎng)相比，微流控芯片子宮更有利于體外小鼠胚胎發(fā)育，分析其原因可能為：（1）子宮內(nèi)膜上皮細胞模擬體內(nèi)子宮內(nèi)環(huán)境，可分泌一些對早期胚胎發(fā)育有利的物質(zhì)；（2）子宮內(nèi)膜上皮細胞可能通過與胚胎的相互作用促進其發(fā)育；（3）所采用的灌流培養(yǎng)方法模擬了生理狀態(tài)細胞與外界的物質(zhì)交換形式，不僅為細胞提供充足的養(yǎng)分， 還可以及時清除對于胚胎發(fā)育不利的代謝產(chǎn)物。綜上所述，研究通過在微流控芯片上細致仿真子宮的結(jié)構(gòu)和功能形成了一個類似于子宮的微環(huán)境。這種芯片子宮有利于卵細胞受精及受精后胚胎的生長發(fā)育，并能得到質(zhì)量較好的胚胎。該技術(shù)除可應(yīng)用于人類生殖醫(yī)學(xué)工程，還可為深入研究胚胎發(fā)育機制及動物胚胎工程提供優(yōu)質(zhì)的胚胎，具有較為廣闊的應(yīng)用前景。4 結(jié) 論

發(fā)展了一種微流控芯片子宮，通過使用子宮內(nèi)膜細胞胚胎共培養(yǎng)以及連續(xù)灌流方式細致模擬子宮環(huán)境以促進胚胎生成。利用上述芯片子宮，完成了排卵、受精、著床以及胚胎發(fā)生等一系列實驗過程。芯片子宮不僅操作簡便，還可以獲得較之傳統(tǒng)方法更高的胚胎形成率。我們的后續(xù)實驗會將芯片子宮發(fā)生的囊胚移植到動物子宮，直至發(fā)育成胎兒。