集成微流體驅動泵的微流控微珠陣列芯片用于基因突變檢測的研究

摘 要 建立了一種基于微泵集成微流控微珠陣列芯片及三磷酸腺苷雙磷酸酶（Apyrase）介導的等位基因特異性延伸的基因突變檢測方法。將微流控芯片、引物修飾微珠陣列及基于毛細和蒸發(fā)作用的微流體驅動泵集成構建檢測芯片，待測目標序列流過裝配的微球陣列并與微球表面延伸引物雜交，在Apyrase和去除外切酶活性的 Klenow DNA 聚合酶協(xié)同作用下，引物3′末端堿基與目標序列包含的基因突變檢測位點匹配則能夠發(fā)生延伸，并將生物素化的dCTP 摻入到引物的延伸序列中并固定在微球表面，鏈霉親和素修飾量子點能與微球表面引物延伸序列中的生物素結合并提供熒光信號，而引物3′末端與目標序列存在單堿基不匹配則不能發(fā)生延伸。結果表明：采用這種單堿基識別技術，微泵驅動的芯片內可以檢測0.2 pmol/L目標序列 （信背比>3），液壓驅動的芯片內能識別0.5 pmol/L目標序列，而芯片外檢測只能識別0.1 nmol/L目標序列，微泵集成芯片在檢測基因突變時其靈敏度較芯片外基因突變分析提高了500倍，并在0.5～30 pmol/L目標序列濃度范圍內待測序列濃度與檢測信號呈良好的線性關系。測定了一個人基因組樣本中多藥耐藥蛋白基因1（MDR1）的兩個多態(tài)性位點C3435T及G2677T，結果顯示該樣本具有3435CT及2677TT的基因型組合，此結果與DNA測序結果一致。本方法用于基因突變分析，具有良好的特異性、靈敏性及穩(wěn)定性。

關鍵詞 微泵；微流控微珠陣列；三磷酸腺苷雙磷酸酶；基因突變；量子點

單核苷酸多態(tài)性 （Single nucleotide polymorphism，SNP）在1996年由美國的Lander提出，目前已得到了廣泛的研究和應用＼[1～3＼]。其研究所揭示的人種、人群和個體之間DNA序列的差異以及這些差異所表現的意義將對疾病的診斷、治療和預防帶來革命性的變化。

目前，用于基因突變的方法主要有等位基因特異性寡核苷酸探針（Allelespecific oligonucleotide， ASO）＼[4＼]、等位基因特異性延伸（Allelespecific primer extension）＼[5＼]、寡核苷酸連接分析技術（Oligonucleotide ligation assay）＼[6＼]、等位基因特異性PCR＼[7＼]等，但這些方法在實際應用過程中仍存在一定的局限，如其特異性低、成本較高等。三磷酸腺苷雙磷酸酶（Apyrase）介導的等位基因特異性延伸＼[8＼]是近年發(fā)展的一種高特異性、低成本的高通量SNP檢測技術，其特點適合商業(yè)化技術的需要。

微流控（Microfluidics）技術是將生物、化學及醫(yī)學分析過程的樣品制備、反應等基本操作微型化、集成化，使檢測過程具備快速、高效、試樣用量少等特點，由于其在生物、化學及醫(yī)學領域的巨大潛力，微流控芯片技術已經發(fā)展成為一個重要的多學科交叉研究領域＼[9～12＼]。微流控微珠傳感是近幾年發(fā)展的一種新型多元微流控技術，該技術整合了基于微陣列的高通量分析技術、基于微流控的微量分析和液流操縱技術以及基于微珠的非均相識別技術，在新型分析技術發(fā)展領域展現出較強的學術價值＼[13～15＼]，但其溶液驅動方式大多為重力驅動或者液壓驅動，溶液流速不易控制，檢測穩(wěn)定性不強。

微流體的驅動和控制是微流控芯片研究中的一種關鍵技術，目前微流體驅動泵主要分為機械微泵＼[16，17＼]和非機械微泵＼[18，19＼]兩類。機械微泵可用多種驅動方式（如靜電驅動、熱氣動力驅動等），但其制造工藝較復雜，且液流常有脈動性。非機械微泵以場感應流微泵為主，由于液流無脈動，流速范圍可在10