制備型液相色譜法及其在制藥和天然產物分離中的應用

李洪彬 周建民 劉 艷

0 引言

色譜法分離是20世紀60年代誕生的一種高效分離純化技術。其利用組分在固定相和流動相中的分配系數的微小差異，當兩相作相對運動時，不同組分將形成不同遷移速度的譜帶，使組分彼此分離，從而達到分離的目的。

制備型高效液相色譜（preparative high performance liquid chromatography，Prep-HPLC）是一種使用高壓、恒流輸液泵系統在高分辨率、大直經、高載量分離柱上進行樣品高純度分離的液相色譜制備方法。該方法分離的產品在純度、回收率、分離效果等方面遠遠優于傳統的制備方法，因此在制藥、天然產物的分離領域中得到了廣泛的應用。對于那些用常規方法難以分離的產物、熱敏性物系以及具有生物活性物系的分離，色譜法具有獨特的優越性。本文就近年來Prep-HPLC方法的研究進展及其在制藥和天然產物分離中的應用作一綜述。

1 制備型高效液相色譜概述

1.1 Prep-HPLC的工作原理及特點

Prep-HPLC的原理是基于20世紀60年代誕生的色譜法分離，其利用組分在固定相和流動相中的分配系數的微小差異，當兩相作相對運動時，不同組分將形成不同遷移速度的譜帶，使組分彼此分離，從而達到分離的目的。與其他分離手段相比，Prep-HPLC具有以下特點：

（1）采用高柱效色譜柱，分離效率高；

（2）可以根據工藝需要自行裝柱，采用動態軸向壓縮柱裝柱，操作簡單，裝填的柱效高；

（3）應用范圍廣，對極性和非極性、離子型和非離子型、小分子和大分子、熱穩定性和熱不穩定性化合物均具有較好的分離效果；

（4）根據分離化合物的性質可配備不同類型的檢測器，如紫外檢測器（UV）、蒸發光散射檢測器（ELSD）、二極管陣列檢測器（DAD）；

（5）可進行工業級大量生產，進樣量大，可連續進樣、生產，完成克級至千克級樣品的分離。

1.2 Prep-HPLC和分析型HPLC的區別

HPLC按照操作方式和目的的不同可分為分析型和制備型2類。分析型是以分離、鑒別及鑒定為目的，不需要對樣品進行回收；Prep-HPLC是從混合物中分離得到純化合物，是一個純化過程，上樣量大，通常需要特定的裝置和一定的操作條件。

1.3 Prep-HPLC的分類

Prep-HPLC根據待分離樣品的量可分為2類，一類為實驗室規模制備，另一類為工業生產型規模制備。實驗室規模制備屬于做研發階段的小試或中試實驗，但也有因為需要的樣品量很少而采取實驗室規模制備的，樣品量為毫克級，分離的樣品一般進行生物活性測定、結構鑒定，以及作為標準品等。這類色譜分離中，經濟效益并不是首要考慮的問題，其對設備精度要求比較高，要達到一定的精度要求，方可進行實驗。對于工業生產型制備高效液相色譜，經濟效益是其整個純化過程考慮的核心因素，純化樣品量為克級至千克級。這類色譜要求達到預期的分離目的，必要時候還要求對溶劑回收利用，避免污染環境。

1.4 影響Prep-HPLC分離的因素

影響Prep-HPLC分離純化的因素有很多，包括色譜柱的柱徑、柱長、填料尺寸、上樣量以及流動相的組成、流速等。

1.4.1 色譜柱尺寸的影響

王志祥等考察了柱子尺寸對柱效和分離度的影響，認為增加柱子長度可以提高分離效果，但相應柱壓也會增大。為了提高制備量，可以使用內徑較大的制備柱，但隨著色譜柱直徑的增大，會產生柱放大效應，使得柱效降低，導致總分離效果下降。

Koh和Guiochon等在動態軸向壓縮條件下研究了色譜柱長度對Prep-HPLC分離效果的影響。在相同的壓縮強度、裝填材料、調漿溶劑等條件下，隨著色譜柱的加長，柱內軸向壓力分布的范圍變大，柱越長，活塞與相反一端的壓力差就會越大，形成的柱床越不穩定、不均勻，裝填密度會越小，從而導致色譜柱產生軸向的壓力梯度和密度梯度。同時，色譜柱越長，空隙率就越大。在裝填過程中，一系列的塌陷主要發生在壓縮開始的幾秒鐘內，此時，床層高度突然而迅速地降低，然后床層的降低變慢。色譜柱越長，發生局部塌陷的機會就越多，達到穩定狀態的時間就越長。

目前，Prep-HPLC裝填的色譜柱長度一般為100～400 mm，在滿足分離度的前提下，應盡量使用較短的制備柱。具體柱子的長度和內徑要根據待分離樣品的性質，通過做實驗反復驗證進行選擇。

1.4.2 色譜填料的影響

在Prep-HPLC中，填料的形狀對柱子性能有很大的影響。對于球形填料，填裝能迅速且平滑地達到穩定狀態，對于形狀不規則填料填裝過程中的床層塌陷不可預測（尤其是當填料微粒較大時），裝填情況非常復雜。不規則填料受壓力的影響較大，當壓力較大時，會有部分微粒發生破碎，從而引起柱長降低，柱壓降隨之變大。而且，不規則填料在整個壓縮過程中都會有微粒發生破碎，這種現象與床層內壓力的分布不均和微粒形成亞穩狀態有關。顯然，這樣就無法確定床層是處于穩態還是亞穩態。如果床層處于亞穩態，任何振動都會引起進一步塌陷。當填料不規則或內孔體積較大時，要采用較小的壓縮壓力。用球形填料裝填得到的柱長的增量與所用干填料的質量增量幾乎成直線關系，而不規則微粒裝填得到的柱長的增量要比干填料的質量增量大，這是因為球形微粒要比不規則微粒填裝的緊密，可壓縮性小。而且，微粒越大裝填密度就會越小，越不穩定，越容易破碎，導致床層壓降增大，柱效降低。

1.4.3 裝柱技術的影響

傳統的裝柱法有干法和濕法裝柱。在20世紀70年代，人們開始嘗試動態軸向壓縮裝柱法（DAC）。現在DAC裝柱已基本上主宰了整個制備型色譜柱市場，聊城萬合工業制造有限公司生產的Prep-HPLC就是采用DAC技術，柱徑為50～1 000 mm，裝填的色譜柱床均勻、性能穩定、柱效高。

1.4.4 上樣量的影響

Prep-HPLC為了提高柱產量，一般采用柱超載方式進行操作。提高處理量可以采用2種操作方式：一種是使用小的注入體積，但增加樣品濃度，即所謂的“質量超載”；另一種是保持較小的樣品濃度，但增加樣品體積，即所謂的“體積超載”。在滿足分離度要求的前提下，可以采用柱超載方式操作，以提高制備量。當一次操作所需要處理的樣品較少時，采用“質量超載”方式更為有利；當一次操作所要處理的樣品的量較多時，采用“體積超載”方式更為有利。

除上述因素外，柱子配流板形狀、樣品黏度、流動相流速、壓縮壓力等因素都會對柱效有所影響，根據經驗并通過反復試驗找到合適的分離方法是和每一個色譜分離工作者的勤奮工作分不開的。

2 Prep-HPLC在制藥和天然產物分離中的應用

2.1 在標準品制備中的應用

市售的雌三醇試劑，考慮到一般性用途及其成本，在常規生產中不可能精制得相當純，而免疫分析用的雌三醇標準品關系到測定樣品中抗原含量的正確定量問題，要求標準品具有高純度，無交叉物存在。楊蘭萍等采用上海第十二制藥廠提供的中間產品雌三醇，用制備型液相色譜制備得到雌三醇的免疫分析用標準品，在制備過程中，通過反復試驗，研究了進樣量、進樣體積對分辨率、峰形的影響及對產品純度的影響，總結出一套合適的制備方法，此方法制備量大，可用于研究和生產領域。

茶氨酸是影響茶葉品質的重要組成部分，約占茶葉中游離氨基酸的40%以上，占茶葉干重的1%～2%。藥理學研究表明茶氨酸能拮抗咖啡堿引起的神經系統興奮，同時具有降壓作用。隨著茶氨酸的保健功效逐漸為人們所認識，市場對茶氨酸的需求不斷上升。目前，國內僅有少量的茶氨酸對照品，且價格昂貴，限制了對其進一步的研究和應用。肖偉濤等采用制備型高效液相色譜技術分離純化茶氨酸對照品，純度達到98%以上，制備收率大于80%。

2.2 在蛋白質和多肽分離制備中的應用

蛋白質和肽類藥物活性強，生物功能明確，特異性高，有利于臨床應用，已成為醫藥產業的一大類重要產品。這些產品無論是來自于生物體內還是由化學合成，往往都帶有復雜的混合成分，而總目的蛋白或肽類的豐度又低，給分離純化帶來困難，需要多種方法聯合使用以獲得純度滿意的產品。在此過程中，Prep-HPLC通常在分離的最后階段被用作獲得高純度產品的關鍵方法。

使用Prep-HPLC制備前，蛋白質和肽類樣品一般先經過傳統分離純化方法，如鹽析、超濾法、凝膠過濾、等電點沉淀、離子交換層析及親和層析等，預先提高純度，然后再進行高純度制備。使用比較普遍的色譜柱是烷基反相鍵合相柱，如C18、C8及C4等，具體選擇因蛋白質相對分子量或疏水性而定。流動相大多為甲醇或乙腈等有機相與水的混合體系，通常還添加三氟醋酸（trifluoroacetic acid，TFA）以增加樣品的溶解度。黃鶴等用C18柱對經離子交換層析后的胸腺素α-1（T細胞免疫增強劑，為酸性較強的28肽）半純品進行了純化，流動相采用0.1%TFA/水和0.1%TFA/90%乙腈溶液梯度系統，可將制備前約65%的純度提高到95%以上，回收率可達80%。韓香等報道用不同的梯度條件，最終產品純度甚至高達98.8%以上。

2.3 Prep-HPLC在生物堿分離制備中的應用

生物堿是自然界中廣泛存在的一大類堿性含氮化合物，是許多中草藥的重要有效成分，在中性或酸性條件下以正離子形式存在。通常，人們用陽離子交換樹脂從其提取液中富集分離生物堿。但是由于植物中含有的生物堿成分復雜、含量低，因此分離比較困難。Prep-HPLC在生物堿分離制備中應用最普遍的是反相制備方法，流動相根據樣品的不同而有很大差異。

紫杉醇是從短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）中提取或半合成的具有抗癌活性的二萜生物堿，屬于廣譜抗腫瘤藥物，臨床應用比較廣泛。但短葉紅豆杉資源珍貴，其提取物中紫杉醇的含量極低（0.000 4%～0.01%），且含有大量的植物蠟、色素和樹膠等雜質，因而無論是從天然植物紅豆杉中還是從培養的植物細胞組織及微生物發酵液中提取紫杉醇，都涉及到如何分離并去除與紫杉醇結構相似的其他紫杉烷類化合物的問題。制備液相是紫杉醇純化應用中的重要手段，并有專用于制備紫杉醇的紫杉醇專用柱。Yang等將經過預處理的4 800 g云南紅豆杉樹皮粗提物用以D956樹脂為填料的工業制備液相色譜柱（250 mm×200 mm）分離，以丙酮/水=40/60～58/42為流動相梯度洗脫，最終制備出約50 g紫杉醇，純度達到99%，回收率在80%以上。

3 Prep-HPLC與其他分離技術的聯用

3.1 Prep-HPLC與大孔吸附樹脂技術的聯用

大孔吸附樹脂是一類不含交換基團，且具有大孔網狀結構和較大表面積的高分子吸附樹脂。大孔吸附樹脂技術在中藥化學成分的提取、分離、富集過程中具有獨特的優勢作用，可有效提高中藥內在質量和制劑水平，降低產品的吸潮性并去除重金屬殘留。提取物經大孔吸附樹脂處理后，可去除多糖、蛋白質及雜質，再通過Prep-HPLC分離即可得到單體化合物，使分離純化過程更加快速、高效，大大節省溶劑的使用量。Zhang等通過大孔吸附樹脂分離并富集了竹葉中的抗氧化物（AOB），再以乙腈21%乙酸水溶液（18B85）為流動相，采用Prep-HPLC從5 L的AOB濃縮液（含粗品615 g）中分離制備了葒草素（49 mg）、異葒草素（142 mg）、牡荊黃素（15 mg）和異牡荊黃素（62 mg）4種黃酮碳苷類成分。

3.2 Prep-HPLC與超臨界CO2萃取技術的聯用

超臨界CO2萃取技術（SFE）是一種新型的提取分離技術，具有操作溫度低、從萃取到分離可一步完成、CO2可循環使用且產品純度和收率高等優點。將SFE和Prep-HPLC聯用，可使天然產物中有效成分純化過程更為環保、快速、高效。

Rochfort等采用SFE和Prep-HPLC聯用技術，從3 g花莖甘藍種子中分離得到1 716 mg蘿卜苷（glucora2 phanin）。技術條件為：C18制備色譜柱（250 mm×10 mm，5μm），流動相為乙腈20%甲酸水溶液；SFE的萃取率為16%。

4 結語

Prep-HPLC是制備純化天然產物的一種有效手段，具有產品純度高、產率高、分離速度快等優點。其未來的發展趨勢是大規模工業化生產，現在的技術已經有了很大提高，無論在設備研發還是在技術工藝開發方面都有了長足的進步。在設備研發方面，聊城萬合工業制造有限公司生產的DAC制備柱和高壓恒流輸液泵已經能滿足絕大部分用戶的需求，國內有很多制藥行業的研發人員也積極參與到制備工藝的研發中，通過樣品的分析條件向制備條件的放大工藝也日趨成熟。

我國的天然產物分布廣泛，種類繁多，對它們的組分結構與生理活性關系的研究以及對天然產物的綜合利用是當今非常令人感興趣的課題。這就要求我們對其成分的分離過程做到至純至微，為此我們必須將各種分離手段結合起來，比如可以和大孔吸附樹脂或超臨界提取聯合使用，并最終用高分辨率的設備將其一一分離鑒定。在此過程中，Prep-HPLC由于具有分辨率高等優點，在將來勢必會成為天然產物分離方面的重要手段之一。（興業杯參賽論文）

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