SAH后下丘腦中5-羥色胺、去甲腎上腺素水平改變及地塞米松的作用

劉艷 熊丹 張小潔 錢聰 信照亮

●論 著

SAH后下丘腦中5-羥色胺、去甲腎上腺素水平改變及地塞米松的作用

劉艷 熊丹 張小潔 錢聰 信照亮

目的 觀察大鼠實驗性蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）后下丘腦組織勻漿5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（Noradrenaline，NA）水平隨時間變化情況，以及地塞米松（dexamethasone，DXM）不同給藥途徑對兩者水平的影響。 方法 實驗大鼠隨機分為空白對照組、SAH組、腹腔給藥組和腦池內給藥組，按時間分為3、7、14、21d 4個亞組，采用高效液相色譜法（HPLC）測定下丘腦組織中5-HT和NA的含量。 結果 5-HT水平在SAH后3d開始上升，7d達到高峰，14d仍維持在較高水平，21d下降到接近3d時的水平；NA的水平從第3天開始上升，第7、14、21天，水平呈逐漸升高的改變，與5-HT變化的時間模式不一致。DXM治療組中5-HT水平均較SAH組明顯降低（均P＜0.05），且兩種用藥途徑間無明顯差異（P＞0.05）；DXM治療對NA水平影響不大（P＞0.05）。 結論 SAH發生后，可導致下丘腦組織中5-HT和NA水平升高，可能與SAH后睡眠/覺醒異常的發生相關，但兩者變化的時間模式不同。DXM可降低SAH后下丘腦組織中5-HT水平，可能是其促進清醒的機制之一。DXM腦池內給藥是一種可選擇的用藥途徑。

蛛網膜下腔出血 5-羥色胺 去甲腎上腺素 地塞米松

蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是神經內、外科的常見疾病。對SAH后蛛網膜下腔內發生的炎癥以及遲發性腦缺血的機制研究很多[1]，而對SAH后的腦組織改變和對腦功能的影響，研究較少[2]。單胺類遞質在睡眠/覺醒中具有重要作用[3]。SAH發生后，是否會引起腦組織中單胺遞質水平的變化，從而導致睡眠/覺醒的異常變化，研究報道不多，且觀察的時間多限于48h內[4]。有研究發現，地塞米松（DXM）蛛網膜下腔（腦池內）應用，能夠減輕腦血管痙攣[5]，是否具有促清醒作用及其機制，未見報道。本實驗將探討SAH后下丘腦組織中5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（Noradrenaline，NA）水平變化模式以及DXM不同用藥途徑對兩者水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 52只健康清潔級雄性SD大鼠，體重250g左右，浙江大學實驗動物中心提供。采用數字表分組法隨機分為：空白對照組（4只）、SAH組（制模后3、7、14、21d各4只）、腦池內給藥組（制模后3、7、14、21d各4只）、腹腔給藥組（制模后3、7、14、21d各4只）。在上述預定的時間進行各項檢測。各組中動物如有死亡則予以補充。

1.2 動物模型的建立 SAH組：采用10%水合氯醛0.35ml/100g腹腔內注射麻醉后，大鼠仰臥位固定于實驗臺上，常規消毒鋪巾后，分離一側股動脈，插入套管針留置備用。之后翻轉大鼠，俯臥頭低位固定，正中切開暴露寰枕筋膜，用特殊制備的穿刺針進行穿刺，成功后先回抽腦脊液0.2ml，然后取股動脈血0.2ml緩慢經穿刺針注入枕大池。拔針后以醫用EC膠封閉硬腦膜穿刺孔，并保持頭低位0.5h。縫合切口，待麻醉復蘇后送回籠中喂養。48h后再次打開寰枕筋膜，枕大池穿刺，注動脈血0.2ml，拔針后再次以醫用EC膠封閉硬腦膜穿刺孔，保持頭低位0.5h，縫合切口，完成兩次注血SAH模型的制作。

腹腔給藥組：SAH模型制作結束，15min后腹腔給予DXM 1 mg/100g大鼠體重。

腦池內給藥組：SAH模型二次注血后，先不拔出穿刺針，15min后注入DXM 0.1mg/100g大鼠體重，給藥完成后再封閉穿刺點。

空白對照組：0.2ml 0.9%氯化鈉溶液代替0.2ml動脈血，步驟同SAH組。

1.3 標本采集及檢測 分別于模型二次注血后3、7、14、21d，大鼠麻醉后，磷酸鹽緩沖液左心室灌注，并剪開右心耳，待流出液變白后，斷頭，快速取出下丘腦。將取出的腦組織放入含有100μM Na2-EDTA和100ng/ml異丙醇/高氯酸的勻漿器中，冰上勻漿20s；勻漿15 000 g離心30min；上清液用1M乙酸鈉溶液調整pH值在3左右；將上清液使用0.45μm的濾膜過濾，用餾分收集器收集過濾液，用高效液相色譜（HPLC）檢測NA和5-HT的水平。HPLC使用反向色譜柱（ODS-80 4.6mm i.d. ×15cm）和電化學檢測儀（Model ECD-100,Eikom Co.,日本），用含有5mg/L Na2-EDTA,15%甲醇，200mg/L辛烷磺酸鈉的乙酸鈉-檸檬酸緩沖液洗脫色譜柱[6]。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料用表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 SAH后下丘腦組織勻漿各組不同時間點5-HT水平的改變 見表1。

表1 SAH后下丘腦組織勻漿各組不同時間點5-HT水平（ng/g腦組織）

由表1可見，SAH組在3、7、14、21d下丘腦5-HT水平均較空白對照組明顯升高（均P＜0.01）；腹腔給藥組在3、7、14、21d下丘腦5-HT水平均較SAH組明顯降低（均P＜0.01）；腦池內給藥組應用DXM組3d下丘腦5-HT水平較SAH組明顯降低（P＜0.01），7d下丘腦5-HT水平較SAH組降低（P＜0.05）。

2.2 SAH后下丘腦組織勻漿各組不同時間點NA水平的改變 見表2。

表2 SAH后下丘腦組織勻漿各組不同時間點NA水平（ng/g腦組織）

由表2可見，SAH組在7、14、21d下丘腦NA水平均較空白對照組升高（均P＜0.05）；腹腔給藥組、腦池內給藥組下丘腦NA水平與SAH組比較，差異無統計學意義（均P＞0.05）。

3 討論

睡眠/覺醒的調節系統包括眾多的神經核團和遞質,彼此間形成相互制約的神經網絡,同時也與內穩態和生物節律的影響有關[7]。一般認為，視前區-下丘腦前部與睡眠相關，下丘腦后部與覺醒相關，且睡眠中樞與喚醒中樞處于交互抑制狀態[8]。有研究發現，下丘腦結節乳頭狀核和腹外側視前區是兩個重要的與睡眠/覺醒相關的區域。因此本研究選擇下丘腦作為觀察的部位。5-HT是一種抑制性神經遞質，除與抑郁癥、焦慮癥、強迫癥、認知和疼痛等密切相關外，5-HT可通過激動不同的受體亞型發揮與睡眠/覺醒調節相關的作用，激動突觸前5-HT1A受體可延長非快速眼動睡眠（NREMS）并減少覺醒；激動突觸后5-HT1A受體可抑制快速眼球運動睡眠（REMS）和促進覺醒；拮抗5-HT2受體可促進NREMS，抑制REMS，促進覺醒[9-13]。NA也是一種神經遞質，在NREMS期緩慢釋放，在REMS期則完全靜止。可見，5-HT與NA是中樞神經系統內重要的單胺類神經遞質，在維持睡眠/覺醒中可能相互協同發揮作用。

文獻報道，腦卒中發生后，單胺類遞質在各腦區有著不同的變化情況，選擇的部位和時間不同結果也各不盡相同。劉國軍等[4]用高效液相色譜儀，觀察對比正常鼠與大腦中動脈栓塞24h后大鼠腦干各區的NA、多巴胺與5-HT含量的變化，在栓塞24h時5-HT明顯高于正常組，并據此認為，多遞質的動態失衡與卒中后睡眠/覺醒障礙的發生有關。

SAH后最常見嚴重的并發癥是遲發性腦缺血，一般在3d出現，7d最為嚴重，14d后開始下降，21d后恢復。有學者用熒光分光光度法檢測了大鼠SAH后48h腦皮質中NA、5-HT和5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）的水平，發現SAH引起腦皮質NA、5-HT和5-HIAA的明顯升高。分腦區研究發現，SAH后NA的升高僅見于腦皮質，腦干、小腦等，其他腦區則無明顯變化（未測定下丘腦區）。5-HT與NA均不易通過血腦屏障，這提示SAH后腦皮質內5-HT和NA水平的升高主要與腦內的合成增加有關。本研究發現，下丘腦5-HT水平在SAH后3d開始上升，7d達到高峰，14d仍維持在較高水平，21d下降到接近3d時的水平，與SAH后的最主要的并發癥遲發性腦缺血的發生時間模式一致（但兩者之間的關聯機制有待證實）。而下丘腦NA的水平，從第3天開始上升，第7、14、21天水平呈逐漸升高的改變，與5-HT水平變化的時間模式不一致。5-HT和NA之間的變化關系有待進一步研究。

糖皮質激素受體（GR）廣泛分布于腦組織。一般認為，糖皮質激素（GC）主要是通過與GR結合后，上調抗炎基因和（或）下調抑炎癥基因的轉錄實現其抗炎作用。DXM是臨床上最常用的GC之一，通過穩定溶酶體膜，誘導T細胞凋亡，抑制細胞因子產生、巨噬細胞移行和致炎物質緩激肽和前列腺素的釋放等發揮作用，還能抑制5-HT產生的作用。GC通過經典受體介導的基因轉錄調節作用需要一定時間，包括GC透過細胞膜到誘導或抑制相關蛋白的轉錄，至少需要30min，蛋白水平變化再引起有治療意義的變化，需要數小時到數天時間；GC也可以通過調節胞質內鈣離子信號在幾分鐘內就發揮快速的作用，而發揮這種非受體依賴機制需要的劑量，必須超過與體內儲備GR結合所需的激素量，這是大劑量沖擊治療的可能機制。不良反應多發生在大劑量應用時，因此探討不同給藥途徑的效果以減輕不良反應是一種選擇。

有實驗證明，DXM腦池內注射對保護腦血管內皮細胞和平滑肌細胞作用顯著，并減輕腦水腫，預防蛛網膜粘連和腦積水發生[14]。本實驗發現，腦池內小劑量注射與腹腔大劑量全身應用，均能降低下丘腦5-HT水平，這可能與DXM的促清醒作用相關，因兩種用藥途徑的作用差異不甚明顯，腦池內小劑量應用可能是一種較好選擇。DXM影響5-HT水平的機制，除可能通過作用于GR抑制5-HT的產生有關外，也可能通過抑制SAH后蛛網膜下腔內的炎癥和免疫反應，改善遲發性腦缺血有關。

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（本文編輯：田云鵬）

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（收稿日期：2012-06-18）

（本文編輯：沈昱平）

Levels of 5-hydroxytryptamine and noradrenaline in rat hypothalamus after subarachnoid hemorrhage and effects of dexamethasone

Objective To investigate the levels of 5-hydroxytryptamine(5-HT)and norepinephrine(NA)in rat hypothalamus after subarachnoid hemorrhage(SAH),and the effect of dexamethasone(DXM)on 5-HT and NA.Methods The rats were randomly divided into 4 groups:the blank,SAH control,SAH treated by intracisternal DXM and SAH treated with intraperitoneal DXM.The levels of 5-HT and NA were measured by high performance liquid chromatograph.Results The 5-HT in hypothalamus tissue began to rise in 3d,reached to peak in 7d,remained at high level in 14d and went down to d3 level in 21d,which was consistent with the timing of delayed cerebral ischemic.The NA in hypothalamus tissue began to rise in 3d and kept rising in 7, 14 and 21d,which was not consistent with the mode of 5-HT.The levels of 5-HT were decreased after DXM treatment and there was no significant difference between intracisternal and intraperitoneal administration.There were no changes of NA levels after DXM treatment.Conclusion 5-HT and NA levels in hypothalamus are increased after SAH,which may be involved in abnormality of sleep/wakefulness,but the time modes of 5-HT and NA are different.DXM may promote wakefulness by lowering 5-HT level in hypothalamus after SAH,and DXM can be administrated intracisternally as an alternative way.

Suharachnold hemorrhage 5-hydroxytryptamine Noradrenaline Dexamethasone

2012-11-22）

國家自然科學基金項目（30370497）；浙江省社會發展項目（2007C33039）

325035 溫州醫學院（劉艷、熊丹、張小潔）；浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院神經外科（錢聰）；溫州醫學院、浙江醫學高等專科學校（信照亮）

信照亮，E-mail:wxk555@sohu.com