咪唑啉2受體配體對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠行為學及基質金屬蛋白酶-9的影響

童巧文 朱英標 鄭榮遠

咪唑啉2受體配體對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠行為學及基質金屬蛋白酶-9的影響

童巧文 朱英標 鄭榮遠

目的 觀察咪唑啉2受體配體（2BFI）對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠的行為、病理和腦脊髓中基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達的影響。 方法 用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG）免疫C57BL/6小鼠制作EAE模型，將小鼠隨機分為5組：藥物干預組（EAE+2BFI 5 mg·kg-1組、EAE+2BFI 10 mg·kg-1組、EAE+2BFI 20 mg·kg-1組）、陽性對照組（EAE+NS組）、正常對照組（完全福氏佐劑+NS組），觀察比較各組行為學和病理組織學的變化，通過RT-PCR技術測定大腦和脊髓MMP-9 mRNA水平，并用免疫組化方法觀測2BFI對大腦組織MMP-9陽性表達的影響。 結果 與EAE+NS組比，2BFI 10、20 mg·kg-1藥物干預組的最高行為學評分和病理變化均有減輕；而且三種不同劑量2BFI干預組大腦和脊髓組織MMP-9mRNA水平和大腦組織中MMP-9陽性表達均較EAE+NS組明顯降低。結論 2BFI對EAE有保護作用，可能與其調節抑制MMP-9，保護血腦屏障，減少炎癥細胞通過血腦屏障有關。

咪唑啉2受體配體 實驗性自身免疫性腦脊髓炎 基質金屬蛋白酶-9

既往眾多研究表明咪唑啉2受體（I2R）與抑郁癥、帕金森病、亨廷頓病、阿片成癮及阿爾茨海默病等神經系統疾病的發生有關[1-2]。咪唑啉受體拮抗劑咪唑克生（idazoxan，Ida）能減輕大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的行為學及病理變化，能明顯減少EAE大鼠中樞神經系統（CNS）內炎癥因子的表達[3]。Ida主要與I2R結合,但同時也具有α2-受體拮抗作用和較弱的5-HT1A受體激動效應。較之Ida，2BFI是一種高選擇性I2R配體，對I2R的結合具有高選擇性（Ki=1.71nM），在兔腦中能夠特異性結合高于90%的I2R結合位點。所以2BFI能夠更好地論證I2R的生物學功能，目前被廣泛用于I2R的相關研究[4-5]。本部分實驗通過采用2BFI對EAE小鼠進行干預，并進一步觀察2BFI對EAE小鼠中樞神經系統中金屬蛋白酶表達的影響，以初步觀察2BFI對EAE的作用及探討相關機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 C57BL/6小鼠40只，雌性，8～10周齡，體重18～20g，由北京軍事動物研究所提供，MOG 35～55多肽（西安美聯多肽技術公司），完全福氏佐劑（CFA）、百日咳毒素（PT，美國Sigma公司）；結核分支桿菌菌素（H37Ra，美國Difco公司）；2BFI（英國Tocris公司）。

1.2 EAE模型建立方法 用0.01mol/L的PBS將MOG 35～55稀釋為200～250μg/ml，然后將稀釋液與等量的CFA（結核桿菌的終濃度為3mg/ml）充分混合，通過三通管將乳劑抽打為油包水狀態，即為誘導EAE的抗原乳劑。EAE組小鼠于背部兩側皮下注射抗原乳劑（內含MOG 35～55抗原250μg/只）。對照組不予抗原處理。免疫后即刻及48h給予全部小鼠（包括對照組）腹腔注射PT，每只動物500ng/0.2ml。

1.3 動物分組 按照分層隨機法編入以下5組：（1）CFA+0.9%氯化鈉溶液（NS）組（8只）：將CFA代替MOG免疫小鼠，并于即刻及48h腹腔注射PT，免疫當天開始給0.1ml，腹腔注射，2次/d，共14d。（2）EAE+NS組（8只）：按上述方法免疫小鼠建立模型，免疫當天開始給NS 0.1ml，腹腔注射，2次/d，共14d。（3）EAE+2BFI 5mg·kg-1組（8只）：同前方法免疫小鼠建立模型，免疫當天開始給2BFI 5mg·kg-1，腹腔注射，2次/d，共14d。（4）EAE+ 2BFI 10 mg·kg-1組（8只）：同前方法免疫小鼠建立模型，免疫當天開始給2BFI 10mg·kg-1，腹腔注射,2次/d，共14d。（5）EAE+2BFI 20 mg·kg-1組（8只）：同前方法免疫小鼠建立模型，免疫當天開始給2BFI 20mg·kg-1，腹腔注射，2次/d，共14d。

1.4 體重檢測及行為學評價 免疫當天起每天對小鼠稱重，連續觀察至小鼠發病高峰期，采用雙盲法進行神經功能評分，并按Weaver15分評分標準進行評分[6]。

1.5 組織取材與病理學檢查 發病小鼠于發病高峰期處死取材，CFA+NS組全部于20d處死。取出大腦和腰髓石蠟包埋后切片，厚度5μm，取大腦視交叉層面、腰髓層面進行HE染色并參照Okuda[7]的病理分度標準進行組織學評分。0：沒有炎癥變化；1：炎癥細胞浸潤僅限于血管周圍和脊膜周圍；2：脊髓內輕微的炎癥細胞浸潤（1～10個細胞/片子）；3：脊髓內中度的炎癥細胞浸潤（11～100個細胞/片子）；4：脊髓內嚴重的炎癥細胞浸潤（＞100個細胞/片子）。

1.6 免疫組化測定MMP-9表達 取腦組織固定、包埋、切片，裱于多聚賴氨酸處理的防脫載玻片上。參考SP法說明書進行免疫組化染色，所有操作均嚴格遵循說明書。同時設陰性對照片，用PBS代替一抗，余步驟相同。棕黃色為陽性染色,無著色為陰性。

1.7 RT-PCR檢測MMP-9mRNA 取50～100mg脊髓，根據Trizol reagent（Invitrogen）的說明一步法抽提總RNA。提取得到的RNA溶于20ml的1‰焦磷酸二乙酯（diethylpyrocar bonate，DEPC）水，取5ml稀釋20倍。RNA提取后根據RT-PCR試劑盒（TaKaRa）的說明合成cDNA。PCR引物通過查找Pubmed基因庫內相應基因的參考序列，應用primer primier 5.0自行設計，由上海生工合成。MMP-9參考序列號為NM0135 99，順義鏈為5′-CTACTCTGAAGACTTGCCG-3′，反義鏈5′-CCATACAGTTTATC CTGGTC-3′，601 bp。β-肌動蛋白（β-actin）參考序列為NM 007393，順義鏈為5′-AGGGAGACCAAAGCCTTCAT-3′，反義鏈為5′-CCCACTCCTAAG AGGATG-3′，214 bp；取順義和反義引物各200ng和1或2ml的cDNA按照RT-PCR試劑盒說明組成20ml的PCR反應體系，94℃預擴增5min后，進入循環體系，MMP-9的擴增條件為，94℃30s→58℃30s→72℃1min，34個循環；β-actin的擴增條件為，94℃30s→55℃30s→72℃1min，32個循環，然后72℃延伸5min。取PCR產物5ml用1.5%的瓊脂糖凝膠（EB 0.5mg·ml-1）電泳，用Gel Documentaion system（BiosensSC6200）凝膠成像系統和Gel-Pro 3.2分析結果，以目的基因與β-actin的灰度Volume之比作為反映目的基因mRNA水平的相對指標。

1.8 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件，計量資料采用表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；兩組比較用t檢驗；率的比較用χ2檢驗。

2 結果

2.1 發病情況 小鼠于免疫后第13天左右開始發病，先出現精神萎靡,體重下降，尾部張力消失，尾巴拖地不能抬起，繼而后肢無力、步態異常、癱瘓，一般于17d左右達到高峰期。與EAE+NS組相比，EAE+2BFI各干預組在發病率、潛伏期、高峰期均無統計學意義，但EAE+2BFI 10 mg·kg-1和20mg·kg-1組神經癥狀評分較EAE+NS組減輕（均P＜0.01），3個EAE+2BFI干預組病理評分較EAE+NS組減輕，差異有統計學意義（P＜0.05或0.01），具有保護EAE的作用；2BFI干預對EAE發病率有減低趨勢（表1）。

2.2 病理學改變 HE染色：CFA+NS組大鼠的腦及脊髓的病理檢查未發現炎性細胞浸潤。EAE+NS組的腦、脊髓實質內小血管周圍有大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞和巨噬細胞為主，典型者呈血管袖套樣改變。脊髓處更為明顯。3個2BFI干預組炎癥浸潤程度均比EAE+ NS組輕，其中以EAE+2BFI 10 mg·kg-1和20 mg·kg-1組有統計學意義（P＜0.05或0.01）（表1）。

2.3 免疫組化結果 MMP-9在EAE小鼠腦內有大量表達，典型的MMP-9陽性細胞胞質出現濃染的棕黃色顆粒，陽性細胞主要表達在脊膜細胞、中性粒細胞、血管內皮細胞的胞質內（圖1～5）。EAE+2BFI 5、10、20 mg· kg-1組CNS中MMP-9表達明顯減少，MMP-9在空白對照組小鼠大腦中表達不明顯。

表1 各組動物發病情況、神經功能評分和病理評分的比較

圖1 CFA對照組大腦，未見MMP-9陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖3 EAE+2BFI 5 mg· kg-1組大腦，可見MMP-9陽性細胞的表達,與EAE組相比其表達減少（免疫組化染色，×400）

2.4 RT-PCR結果 大腦和脊髓MMP-9 mRNA的表達，可見EAE+2BFI 5、10、20 mg·kg-1干預組較EAE+NS組明顯減少（均P＜0.01），其中EAE+2BFI 10、20mg·kg-1與EAE+2BFI 5 mg·kg-1比較，差異也有統計學意義（均P＜0.01），說明前兩組對MMP-9降低作用更為明顯（表2、圖6）。

表2 2BFI對EAE小鼠腦和脊髓MMP-9 m RNA表達的影響

圖6 各組中樞系統MMP-9mRNA的表達電泳圖

圖 4 EAE+2BFI 10 mg· kg-1組大腦，可見MMP-9陽性細胞的表達,與EAE組相比其表達減少（免疫組化染色，×400）

圖 5 EAE+2BFI 20 mg· kg-1組大腦，可見MMP-9陽性細胞的表達,與EAE組相比其表達減少（免疫組化染色，×400）

3 討論

目前認為多發性硬化及其動物模型是以T細胞介導為主的以中樞神經系統單核細胞浸潤、白質脫髓鞘和軸索損傷為特征的自身免疫反應性疾病。其中血腦屏障（BBB）的破壞導致炎癥細胞侵入CNS的過程是EAE發病的重要環節。

MMP-9又稱明膠酶B，其主要降解明膠、Ⅳ、Ⅴ型膠原、彈性蛋白等，參與了MS的局灶性血腦屏障損害、淋巴細胞募集、血管周圍炎癥浸潤等病理損害。體外實驗表明MMP-9通過降解血管內皮細胞中的基質蛋白而增加微血管通透性，介導炎癥細胞穿透BBB[8]。Kieseier等[9]發現在EAE大鼠模型中MMP-9mRNA水平較正常組明顯增高，MMP-9達峰值與疾病嚴重程度一致，明膠酶譜法亦證明MMP-9的蛋白水解活性增加。無論在EAE小鼠還是MS患者CFS中均發現MMP-9蛋白表達增加，并且與病情相關[10-11]。Dubois等[12]發現＜4周齡的MMP-9敲除小鼠相對于正常小鼠對EAE的易感性降低，平均臨床評分明顯減少，但是上述現象在成年鼠實驗中并不明顯。以上研究均提示MMP-9對EAE或MS的發病有著重要作用。本實驗免疫組化顯示EAE+ NS組小鼠腦組織內MMP-9陽性細胞的表達增多，而CFA+NS對照組未見MMP-9陽性表達，此結果與上述觀點一致。

本實驗應用2BFI來干預EAE，結果發現EAE+ 2BFI 10、20mg·kg-1干預組小鼠臨床評分和病理學評分均明顯低于EAE+NS組大鼠。根據我們實驗的免疫組化染色和RT-PCR檢測結果，3個不同劑量2BFI干預組小鼠腦脊髓MMP-9的表達明顯低于EAE陽性對照組，其中以EAE+2BFI 10、20mg·kg-1兩組更為明顯。故EAE+2BFI組中對MMP-9的抑制在宏觀水平、蛋白水平及轉錄水平均有體現。提示2BFI能夠抑制EAE的發病，減輕發病小鼠的臨床癥狀。這可能是由于2BFI的作用使得星形膠質細胞的增值活化作用，并減少其氧化應激反應，促進EAE恢復。在既往的研究已經報道咪唑啉配體能增加星形膠質細胞上GFAP標志蛋白的表達，并促進其活化增殖[13-14]。Pagenstecher等[15]發現在EAE中，激活的星形膠質細胞能產生多種TIMPs（金屬蛋白酶組織抑制劑），導致MMP-9降低。因此2BFI可能同時參與調節EAE中MMPs和TIMPs的失衡。

綜上所述，2BFI作為咪唑啉受體配體對EAE具有保護作用，減輕臨床癥狀和病理組織學損傷程度，降低EAE小鼠MMP-9的表達。因此，可以將咪唑啉受體的應用作為一種治療EAE或MS的新思路，進一步研究和探索其保護機制。

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Effect of 2BFI on behavior and MMP-9 expression in experimental autoimmune encephalomyelitis mice

2BFIExperimental autoimmune encephalomyelitisrats(EAE)Matrix metalloproteinase-9(MMP-9)

2012-05-14）

（本文編輯：沈昱平）

國家自然科學基金資助項目（81070960）；浙江省自然科學基金資助項目（Y2090923）

325000 溫州市人民醫院神經內科（童巧文）；麗水市人民醫院神經內科（朱英標）；溫州醫學院附屬第一醫院神經內科（鄭榮遠）

鄭榮遠，E-mail:zhengry@yahoo.com.cn

【 Abstract】Objective To investigate the effect of 2BFI on the behavior and MMP-9 expression in experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)mice,Methods C57B/L mice were immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG)to establish the mice model of EAE.The mice were randomly divided into 5 groups：EAE+2BFI groups(2BFI 5 mg·kg-1,10 mg·kg-1and 20 mg·kg-1),EAE+NS group and CFA+NS group.After immunization,the mice in EAE+2BFI groups were treated with intraperitoneal injection of 2BFI 5 mg·kg-1,10 mg·kg-1and 20 mg·kg-1,respectively;whereas the mice in EAE+NS and CFA+NS groups were treated with an intraperitoneal injection of 0.1ml normal saline.The immunohistochemical staining was used to detect the expression of MMP-9 protein and RT-PCR was used to determine MMP-9 mRNA expression.Results In 2BFI 10 and 20 mg·kg-1groups,the maximum clinical scores and pathological change were both decreased.Compare with EAE+NS Group,the expression of MMP-9 protein and mRNA in the brain of EAE mice was decreased in three EAE+2BFI groups.Conclusion 2BFI can protect mice from EAE,which is associated with reduced MMP-9 expression in central nervous system.