冬凌草甲素對人肺癌A549和PC-9細胞侵襲的抑制作用和機制研究

王健，周雯，宋秀宇，徐文貴，黃純

冬凌草甲素對人肺癌A549和PC-9細胞侵襲的抑制作用和機制研究

王健1，周雯2△，宋秀宇1，徐文貴1，黃純3

目的探討天然產物衍生物冬凌草甲素對人肺癌細胞體外侵襲的抑制作用及其機制。方法冬凌草甲素處理人肺癌細胞系A549和PC-9后，應用細胞增殖實驗（MTS）法檢測腫瘤細胞生長，Transwell試驗檢測腫瘤侵襲能力，黏附試驗檢測腫瘤黏附能力，流式細胞術檢測腫瘤細胞周期，Western blotting和Realtime-PCR檢測細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p53、p21、E-鈣黏素（E-cadherin）、CD44、β-catenin、尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）、基質金屬蛋白酶（MMP）-2/9、p-AKT和磷酸化酪氨酸激酶（p-Src）表達，報告基因技術考察核因子（NF）-κB轉錄活性。結果冬凌草甲素顯著抑制A549和PC-9細胞的體外增殖、黏附和侵襲，將細胞周期阻滯在G2/M期，冬凌草甲素促進E-cadherin、p53和p21的表達，下調CDK1、mTOR、CD44、β-catenin、uPA、MMP-2/9、p-AKT和p-Src表達和NF-κB轉錄活性。結論冬凌草甲素可抑制人肺癌細胞系A549和PC-9的體外侵襲能力，可能與其調節酪氨酸激酶活性有關。

冬凌草素；肺腫瘤；腫瘤侵潤；A549；PC-9

肺癌是我國一種常見的癌癥，復發轉移是其治療的主要困難［1］。目前，對于晚期不能進行手術的患者仍然缺乏有效的治療藥物。研究發現，冬凌草甲素具有廣泛且極其顯著的抗腫瘤作用，但是其抑制肺癌的作用機制尚不清楚［2-3］。本研究重點考察冬凌草甲素對肺癌A549和PC-9細胞系體外侵襲的抑制作用，并對其分子機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器人肺癌A549和PC-9細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（上海）；單溶液細胞增殖檢測試劑盒（MTS）、Realtime-PCR試劑盒、核因子（NF）-κB熒光素酶質粒和熒光素檢測試劑盒購自Promega公司；冬凌草甲素購自Sigma-Aldrich公司；細胞周期和凋亡檢測試劑盒購自BD Biosciences；各種單克隆抗體購自Santa Cruz公司；ECL免疫印跡底物試劑盒購自Millipore公司；細胞侵襲檢測試劑盒購自R&D Systems公司。

1.2 細胞培養細胞培養于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中，培養基為DMEM，添加10%胎牛血清。0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有實驗均采用對數生長期細胞。

1.3 MTS細胞生長檢測取對數生長期的細胞，以8×104個/mL接種于96孔微孔板中，每孔100 μL，培養過夜使細胞貼壁。分別加入0、0.5、1、2、5、10、20、50和100 μmol/L的冬凌草甲素，繼續培養48 h，吸去培養基，按照試劑盒說明書的要求加入MTS，繼續培養4 h。最后用酶標儀測定490 nm波長下的光密度（OD）值，以OD值表示細胞的數量。計算藥物對細胞的抑制率。抑制率（IC）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.4 細胞培養細胞分為對照組、8 μmol/L組和16 μmol/L組，后兩組分別加入8 μmol/L和16 μmol/L冬凌草甲素，每個實驗設置3個復孔，繼續培養48 h，備用。

1.5 體外侵襲和黏附試驗將腫瘤細胞接種Transwell的上室，同時加入備用細胞，洗去膜上未侵襲細胞，甲醛固定，HE染色，觀察腫瘤細胞侵襲情況。侵襲率=（處理組細胞侵襲數/對照組細胞侵襲數）×100%。消化、離心，培養于包裹有Matrigel的96孔板1 h，加入MTS試劑孵育4 h，通過酶標儀在490 nm檢測OD值，觀察腫瘤細胞黏附情況。黏附率=（處理組OD值/對照組OD值）×100%。

1.6 細胞周期檢測備用細胞經70%乙醇透化4℃過夜，洗滌后經含有RnaseA的PI染液孵育30 min，通過流式細胞術在490 nm檢測熒光強度，觀察細胞周期變化。

1.7 Western blotting實驗收集備用細胞裂解提取蛋白。以12%SDS-PAGE法分離蛋白質，然后轉移至PVDF膜上，以不同的抗體［細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p53、p21、E-鈣黏素（E-cadherin）、CD44、β-catenin、尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）、基質金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9為1∶1 500；p-AKT和磷酸化酪氨酸激酶（p-Src）為1∶1 000］4℃孵育過夜，洗去一抗后，以辣根過氧化物酶（HRP）連接的二抗（1∶2 000）溫育1 h，洗滌，以增強化學發光法（ECL）試劑盒顯示免疫反應條帶。β-actin作為內參。

1.8 Realtime-PCR實驗備用細胞用Trizol法提取各組總RNA，用Realtime-PCR試劑盒進行逆轉錄得到cDNA，然后檢測mRNA水平，引物序列見表1。

1.9 報告基因實驗將NF-κB熒光素酶質粒轉染至細胞中，培養6 h，更換培養基，分別加入8 μmol/L和16 μmol/L冬凌草甲素，繼續培養48 h，通過熒光素酶檢測試劑盒檢測細胞熒光強度，考察NF-κB轉錄活性變化。

1.10 統計學方法使用SPSS 13.0軟件進行分析，以均數±標準差表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行比較，組間多重比較采用Turkey法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

Tab.1 The Real time PCR oligonucleotide sequences表1 Realtime PCR引物序列

2 結果

2.1 冬凌草甲素對A549和PC-9細胞的體外增殖作用冬凌草甲素可抑制A549和PC-9細胞的體外增殖，A549細胞半數抑制率（IC50）為21.3 μmol/L，PC-9細胞IC50為18.4 μmol/L，見圖1。

Fig.1 The inhibitory effects of oridonin on the proliferation of human lung cancer A549 and PC-9 cell lines in vitro圖1 冬凌草甲素對人肺癌A549和PC-9細胞體外增殖的抑制作用

2.2 冬凌草甲素對A549和PC-9細胞的體外侵襲和黏附的抑制作用A549細胞體外侵襲和黏附能力3組間差異有統計學意義（F分別為97.216和272.727，均P＜0.01）。與對照組比較，8 μmol/L和16 μmol/L組體外侵襲率分別為71.2%和53.8%，體外黏附率分別為62.1%和37.1%（均P＜0.01）。PC9細胞體外侵襲和黏附能力3組間差異有統計學意義（F分別為145.787和78.830，P＜0.01）。與對照組比較，8 μmol/L和16 μmol/L組體外侵襲能力分別下降65.5%和48.6%，體外黏附能力分別下降73.8%和56.5%（均P＜0.01），見圖2。

Fig.2 The inhibitory effects oridonin on the invasion and adhesion of human lung cancer A549 and PC-9 cell lines in vitro圖2 冬凌草甲素對人肺癌A549和PC-9細胞體外侵襲和黏附的抑制作用

2.3 冬凌草甲素對A549和PC-9細胞阻滯作用流式細胞術結果顯示，A549細胞和PC-9細胞冬凌草甲素處理組與對照組相比，G2/M期細胞的比例增加，且呈現劑量相關性，見表2、圖3。

2.4 冬凌草甲素對A549和PC-9細胞中腫瘤相關基因、蛋白表達的影響Western blotting結果顯示，A549細胞和PC-9細胞冬凌草甲素處理組與對照組相比，E-cadherin、p53和p21的表達上調，CD44、β-catenin、MMP-2、MMP-9、CDK1、mTOR、uPA、p-AKT和p-Src表達下調。Realtime-PCR結果顯示，A549細胞和PC-9細胞冬凌草甲素處理組與對照組相比，E-cadherin、p53、p21 mRNA表達上調，CDK1、mTOR、CD44、β-catenin、uPA、MMP-2和MMP-9 mRNA表達下調，見圖4。

2.5 冬凌草甲素對A549和PC-9細胞NF-κB轉錄活性的下調作用經過冬凌草甲素作用后，A549細胞和PC-9細胞NF-κB轉錄活性均顯著下調，見表3。

Tab.2 The effects of different doses of oridonin on cell cycle of human lung cancer A549 and PC-9 cell lines表2 不同劑量冬凌草甲素對A549和PC-9細胞的細胞周期阻滯效果（n=3，%）

Tab.2 The effects of different doses of oridonin on cell cycle of human lung cancer A549 and PC-9 cell lines表2 不同劑量冬凌草甲素對A549和PC-9細胞的細胞周期阻滯效果（n=3，%）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與8 μmol/L組比較，P＜0.05；表3同

組別對照組8 μmol/L組16 μmol/L組F A549細胞G0/G1 40.99±2.06 26.53±1.33a 18.42±0.93ab 168.121＊＊S 32.30±1.62 23.82±1.20a 30.40±1.52b 27.264＊＊G2/M 26.71±3.69 49.65±2.53a 51.18±2.46ab 64.020＊＊組別對照組8 μmol/L組16 μmol/L組F PC-9細胞G0/G1 52.92±2.67 35.38±1.78a 22.35±1.12ab 180.936＊＊S 22.21±1.12 30.96±1.56a 39.16±1.97ab 84.228＊＊G2/M 24.87±1.12 33.66±1.56a 38.49±1.14ab 12.085＊＊

Fig.3 The effects of oridonin on cell cycle of human lung cancer A549 and PC-9 cell lines圖3 冬凌草甲素對人肺癌A549和PC-9細胞周期的影響

3 討論

冬凌草甲素是冬凌草中的主要活性成分，對前列腺癌、乳腺癌等多種細胞均有顯著的抑制作用。最近研究發現，冬凌草甲素對肺癌細胞也有較強的抑制作用，但是其對肺癌細胞體外侵襲的抑制作用和機制尚不清晰。本研究發現，冬凌草甲素可顯著抑制肺癌A549和PC9細胞體外增殖和侵襲。筆者采用較低濃度（8 μmol/L）和接近IC50濃度（16 μmol/ L）進行后續研究，用以考察不同濃度的藥物對腫瘤侵襲的影響，并探討其機制。

為探討冬凌草甲素阻滯細胞周期的機制，筆者利用Western blotting和Realtime-PCR檢測發現冬凌草甲素可上調腫瘤細胞中p53和p21的表達。p53和p21均是細胞周期的負調控蛋白，其中p21是細胞G1期所必需的細胞周期性激酶，可抑制CDK1、CDK2和CDK4/6的活性，具有更加廣泛的作用，可將細胞阻滯在G1和S期［4-7］，說明冬凌草甲素可能通過上調p53和p21的表達以實現對腫瘤細胞周期的抑制。

Fig.4 The effects of oridonin on the expression of tumor-related gene of human lung cancer A549 and PC-9 cell lines圖4 冬凌草甲素對人肺癌A549和PC-9細胞中腫瘤相關基因表達的影響

Tab.3The effects of different doses of oridonin on promoter activity of NF-κB of human lung cancer A549 and PC-9 cell lines表3 不同劑量冬凌草甲素對A549和PC-9細胞NF-κB轉錄活性的影響（n=3，%，）

Tab.3The effects of different doses of oridonin on promoter activity of NF-κB of human lung cancer A549 and PC-9 cell lines表3 不同劑量冬凌草甲素對A549和PC-9細胞NF-κB轉錄活性的影響（n=3，%，）

組別對照組8 μmol/L組16μmol/L組F A549 100.00±0.00 84.73±6.87a64.77±5.26ab37.529＊＊PC-9 100.00±0.00 76.00±6.17a61.37±4.96ab54.650＊＊

本研究發現，冬凌草甲素還可下調腫瘤細胞中CD44和MMP-2/9表達，從而抑制腫瘤細胞異質黏附和基質穿透能力。uPA被證明與腫瘤發生發展和轉移密切相關，酪氨酸激酶能催化多種蛋白酪氨酸殘基磷酸化，在腫瘤細胞的發生發展過程中具有重要作用［8-10］。本研究發現冬凌草甲素還可以下調uPA表達和酪氨酸激酶活性，被認為是其抑制腫瘤侵襲的另一潛在機制。

β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵調控因子，其過度活化可造成腫瘤等疾病［11］。AKT/ NF-κB信號通路對肺癌的進展發揮重要作用，是常見的腫瘤治療靶點。mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，受到AKT/NF-κB調控，抑制其活化可調控癌基因的轉化［12-14］。本研究結果顯示，冬凌草甲素可以調節AKT/NF-κB信號通路的活性，下調β-catenin和mTOR表達。

總之，本研究顯示冬凌草甲素可抑制人肺癌A549和PC-9細胞增殖和侵襲，其機制可能與抑制酪氨酸激酶活性有關，今后將進一步深入探討其對腫瘤抑制作用的機制，為臨床應用提供實驗基礎。

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（2015-05-29收稿2015-06-24修回）

（本文編輯魏杰）

The inhibitory effects and mechanisms of oridonin on invasion of human lung cancer A549 and PC9 cells

WANG Jian1，ZHOU Wen2△，SONG Xiuyu1，XU Wengui1，HUANG Chun3
1 Department of Molecular Imaging and Nuclear Medicine，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China；2 Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics（Theranostics），School of Pharmacy，Tianjin Medical University；3 Department of Thoracic Medical Oncology，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital△

ObjectiveTo investigate the inhibitory effects and mechanisms of a nature product derivate oridonin on in?vasion of human lung cancer.MethodsHuman lung cancer A549 and PC-9 cell lines were treated with oridonin.MTS as?say was used to determine cell proliferation.Transwell assay was used to determine the cell invasion，and adhesion assay to determine the cell adhesion.Flow cytometry was used to determine cell cycle.Western blotting and realtime-PCR were used to detect expression levels of CDK1，mTOR，p53，p21，E-cadherin，CD44，β-catenin，uPA，MMP-2/9，p-AKT and p-Src. The luciferase reporter assay was used to detect the NF-κB promoter activity.ResultsIn vitro proliferation，invasion and adhesion of A549 and PC-9 cells were significantly inhibited by oridonin.The cell cycle was halted by G2/M phase，and ex?pressions of E-cadherin，p53 and p21 were promoted，while expressions of CDK1，mTOR，CD44，β-catenin，uPA，MMP-2/ 9，p-AKT and p-Src and promoter activity of NF-κB were down-regulated.ConclusionOridonin is able to inhibit the in vitro invasion of human lung cancer A549 and PC-9 cell lines，which might be correlated with its abilities to regulate the ty?rosine kinase activity.

Rubescensine；lung neoplasms；neoplasm invasiveness；A549；PC-9

R734.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.002

國家自然科學基金資助項目（81372467，81101776）

1天津醫科大學腫瘤醫院分子影像與核醫學診療科、國家腫瘤臨床醫學研究中心、天津市"腫瘤防治"重點實驗室（郵編300060）；2天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室、天津醫科大學藥學院；3天津醫科大學腫瘤醫院肺部腫瘤內科

王健（1981），男，主管藥師，主要從事藥物化學方面研究

△通訊作者E-mail：wwbzzl@sina.com