miR-139-3p在胃癌組織中的表達及其對細胞增殖和凋亡的作用

陳樂高 姚海波 關天培 葉再元 陶厚權

●論 著

miR-139-3p在胃癌組織中的表達及其對細胞增殖和凋亡的作用

陳樂高 姚海波 關天培 葉再元 陶厚權

目的 研究miR-139-3p在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平及其對AGS和SGC-7901胃癌細胞株的增殖和凋亡的作用。 方法 采用qRT-PCR檢測38例患者胃癌組織與癌旁組織中miR-139-3p的表達情況，并分析miR-139-3p的表達與胃癌臨床病理特征之間的關系；利用miR-139-3p抑制劑下調胃癌細胞株中miR-139-3p的表達，MTT法檢測對AGS和SGC-7901細胞增殖的影響，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。 結果 miR-139-3p在胃癌組織中表達高于癌旁組織（P＜0.01），其表達增高與腫瘤大小和部位相關（均P＜0.05）；下調miR-139-3p的表達能夠抑制胃癌細胞的增殖、促進細胞凋亡（均P＜0.05）。 結論miR-139-3p在胃癌組織中表達增高，可能參與胃癌的發生、發展過程。

miR-139-3p 胃癌 AGS細胞 SGC-7901細胞 細胞增殖 細胞凋亡

miR-139-3p Gastric cancerAGS cellSGC-7901 cellCell proliferation Cell apoptosis

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在我國發病率和病死率都非常高[1]。近年來研究發現microRNA（miR NA），作為一種非編碼的內源性RNA，在腫瘤的發生、發展中起著重要作用[2]。已有實驗證明，異常表達的miRNA，如miR-101、miR-199a等在胃癌的發生、發展中起到重要作用[3-4]。在前期研究利用microRNA芯片篩選出胃癌中異常表達的miRNA，其中miR-139-3p異常表達增高。本研究采用實時定量PCR（qRT-PCR）檢測胃癌組織與癌旁組織中miR-139-3p的表達情況；分析其表達量與胃癌臨床病理特性之間的關系；通過miR-139-3p抑制劑下調胃癌細胞株AGS、SGC-7901中的miR-139-3p的表達，進一步分析miR-139-3p對胃癌細胞增殖和凋亡的作用，為進一步研究其在胃癌中的分子生物學機制和發現新的治療靶點提供依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集浙江省人民醫院2011-02—06收治的38例新鮮胃癌手術切除標本及癌旁組織（距腫瘤組織5cm以上）。所有病例均經病理確診，且術前未接受過放化療。其中男26例，女12例，年齡34～86歲，中位年齡57歲。腫瘤組織根據美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer,AJCC）胃癌TNM分期（2010年第7版）進行病理分期。

1.2 材料 胃癌細胞株AGS和SGC-7901購自于上海細胞庫；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqTMII定量PCR試劑盒購自TAKARA公司；Anti-hsa-miR-139-3p miScript miRNA Inhibitor試劑（MIN0004552）和 miScript Inhibitor Negative Control試劑（1027271）購自于美國QIAGEN公司；GAVA Nexin V Reagent凋亡試劑盒購自德國Millipore公司。

1.3 胃癌組織及癌旁組織中miR-139-3p的檢測

1.3.1 總RNA提取和反轉錄 按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。利用miRNA cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄反應，反應體系：2×miRNA Reaction Buffer Mix 10μl，0.1%PBS 2μl，miRNA PrimeScrip RT Enzyme Mix 2μl，Total RNA 1μl RNase Free dH2O 5μl；反應條件：37℃60min，85℃5s。

1.3.2 Real-time PCR miR-139-3p的正向特異性引物序列為：GGAGACGCGGCCCTGTTGGAGT，內參U6B的正向特異性引物序列為：ACGCAAATTCGTGAAGCGTT；反向引物為逆轉錄試劑盒中提供的通用引物。PCR反應體系：SYBR Premix 10μl，Rox 0.4μl，正反向引物各0.5μl，模板1 μl，dH2O 7.6μl；反應條件：94℃4min，1個循環；94℃5s，55℃20s，72℃20s，40個循環；熔解曲線程序：95℃1min，55℃30s，95℃30s，1個循環。

1.4 胃癌細胞株中miR-139-3p抑制劑的轉染 取對數生長期AGS和7901細胞接種于6孔板中（細胞濃度2×105個/孔）。按轉染試劑盒要求，將miR-139-3p抑制劑Anti-hsa-miR-139-3p miScript miRNA Inhibitor作用于細胞，作為實驗組；將miScript Inhibitor Negative Control作用于細胞，作為對照組。轉染24h后，利用qRT-PCR檢測轉染效果及進行細胞實驗。

1.5 MTT檢測增殖率 收集上述實驗組和對照組細胞，調整細胞濃度為1×105個/ml。將200μl細胞懸液接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱內。分別在培養24、48、72h后，每孔加入20μl MTT液（5mg/ml），繼續培養4h后取出培養板。吸凈上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩15min。以630nm為參考波長，570nm為測定波長，用多功能酶標儀（Infinite M200）測定每孔的吸光度（A）。相對增殖率（%）=實驗組（A570nm-A630nm）/對照組（A570nm-A630nm）× 100%。

1.6 流式細胞儀檢測凋亡 取上述實驗組和對照組細胞，用0.25%胰酶消化后，PBS洗滌2次，離心去除PBS，加入200μl凋亡試劑染色，混勻，避光放置30min，再次混勻，吸100μl細胞混合液至96孔板中，加入100μl培養基后上機檢測。

1.7 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件，計量資料均以表示，配對計量資料采用配對樣本t檢驗；等級資料采用χ2或Fisher確切概率檢驗。

2 結果

2.1 miR-139-3p在胃癌組織中表達增高 胃癌組織中miR-139-3p的相對表達量（1.36×10-4±4.01×10-5），高于癌旁正常組織（7.87×10-5±2.81×10-5）。兩者比較具有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 miR-139-3p在胃癌及癌旁組織中表達

2.2 miR-139-3p的表達與臨床病理特征的關系 miR-139-3p的表達增高與胃癌患者的腫瘤部位、直徑相關（P＜0.05），而與患者性別、年齡、分化程度、TNM分期等無關（均P＞0.05），見表1。

2.3 抑制劑對miR-139-3p表達的影響 qRT-PCR的檢測結果表明實驗組的miR-139-3p表達量明顯低于對照組（P＜0.05）。提示miR-139-3p抑制劑能夠抑制胃癌細胞中miR-139-3p的表達，見圖2。

2.4 下調miR-139-3p對胃癌細胞增殖的影響 MTT實驗結果表明，下調miR-139-3p的表達能夠抑制胃癌細胞的增殖。培養24、48、72h后，實驗組AGS細胞相對增殖率分別為95.3%±2.18%、87.5%±2.04%、83.8%± 3.59%（均P＜0.05）；實驗組SGC-7019細胞相對增殖率分別為92.1%±4.22%、85.3%±1.76%、74.7%±3.39%（均P＜0.05）。提示下調miR-139-3p對胃癌細胞的增殖有明顯的抑制作用，見圖3。

2.5 下調miR-139-3p的表達對胃癌細胞凋亡的作用 下調miR-139-3p的表達后，AGS細胞的早期凋亡比例從7.03%±1.02%增加到16.83%±2.21%，具有統計學差異（P＜0.01），而SGC-7901細胞的早期凋亡比例增加無統計學差異（7.60%±2.05%vs 8.13%±0.77%，P＞0.05），見圖4。

表1 miR-139-3p的表達與胃癌患者臨床病理特征的關系

圖2 抑制劑下調miR-139-3p在胃癌細胞中的表達

圖3 MTT法檢測下調miR-139-3p后胃癌細胞增殖情況

圖4 流式細胞儀檢測下調miR-139-3p后胃癌細胞凋亡情況

3 討論

miRNAs是一類由18～23個核苷酸構成的單鏈非編碼RNA分子，其本身不編碼蛋白質，但是可以通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區（3′-untranslational region，UTR）結合，抑制mRNA的翻譯或降解翻譯產物導致靶基因的轉錄后沉默，從而參與靶基因功能的調節。miRNA參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發育、細胞增殖、分化和凋亡等[2]。近年來研究發現[5]，miRNA還與腫瘤的發生、發展有著密切關系。有研究表明，大約50%的人類miRNA基因位于染色體的易碎片段和腫瘤相關區域，而腫瘤的發生常常與這些基因的擴增或丟失密切相關。miRNA表達失調的現象普遍存在于肺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌等多種腫瘤中，并且不同腫瘤其miRNA表達譜也有很大差異[6-11]。miRNA具有類癌基因或類抑癌基因的功能，類癌基因樣miRNA在腫瘤中表達增高或類抑癌基因樣miRNA的表達降低能下調抑癌基因的活性，促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移或耐藥等，在腫瘤的發生、發展中起著重要作用[12]。

近來大量研究表明，胃癌是一種多基因疾病，其發生、發展是一個多步驟參與、多種相關基因失活導致的結果。miRNA可以作為癌基因或抑癌基因在胃癌中發揮促癌或抑癌作用。Xia等[13]研究表明，miR-124能夠與SPHK1基因的3′-UTR結合來抑制該基因表達，從而抑制胃癌細胞的增殖。Zhang等[14]報道，miR-181a能夠促進胃癌細胞7901增殖、克隆形成、侵襲和遷移，抑制細胞凋亡，而且進一步原位雜交和熒光素酶報告基因結果顯示抑癌基因KLF6的表達被其抑制。Liu等[15]研究發現，miR-221在胃癌組織中高表達，且與淋巴結轉移、浸潤深度和淋巴遠處轉移相關，Cox比例風險回歸模型提示高表達miR-221可能是胃癌預后的一個危險因子。Zhang等[16]用實時定量PCR證實miR-21在人胃癌組織及細胞株中顯著過表達，在人胃癌細胞株AGS中，miR-21的高表達能顯著增強細胞增殖和侵襲能力，而敲除miR-21導致細胞凋亡顯著增加，增殖、侵襲和遷移能力明顯下降，進一步研究證實RECK（一種已知的胃癌抑制基因）是miR-21的靶點，即miRNA先通過下調RECK，然后導致胃癌發生。本研究表明miR-139-3p在胃癌組織中表達量高于癌旁組織，且miR-139-3p的表達增高與腫瘤大小、部位相關，當miR-139-3p被下調后，胃癌細胞株AGS和SGC-7901的增殖被抑制，且AGS細胞凋亡比例增加。

miR-139-3p的異常表達在其他惡性腫瘤中也有報道。Schmitz等[17]發現，miR-139-3p在惡性腎上腺皮質瘤中表達量增加了7.49倍，提示miR-139-3p可作為一個惡性腎上腺皮質瘤的診斷因子。Shen等[18]報道發現，miR-139-3p高表達與結腸癌肝轉移正相關，提示其可能參與了結腸癌的遠處轉移。然而陽圣等[19]利用miRNA芯片檢測發現胃癌中miR-139-3p表達下調，這與本實驗結果相反，可能與實驗的樣本數量及實驗方法不同有關。

綜上所述，本研究發現miR-139-3p在胃癌組織中表達升高，且與胃癌的腫瘤大小、部位相關。下調miR-139-3p可抑制胃癌細胞的增殖，促進胃癌細胞凋亡。推測miR-139-3p可能參與了胃癌發生、發展，其具體機制尚需進一步研究。

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2012-09-04）

（本文編輯：胥昀）

國家自然科學基金（81071991）

325000 溫州醫學院第一臨床醫學院 (陳樂高、姚海波、關天培、葉再元，陳樂高系碩士研究生)；浙江省人民醫院胃腸外科（葉再元、陶厚權）

葉再元，E-mail：zaiyuanye@163.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of miR-139-3p on proliferation and apoptosis in gastric cancer. Methods The expression of miR-139-3p in gastric cancer and pericancerous tissues was examined by Real-time PCR.The correlation between miR-139-3p expression and clinicopathologic features of gastric cancer was analyzed.The cultured gastric cancer AGS and SGC-7901 cells were treated with miR-139-3p Inhibitor;the cell proliferation was detected by MTT assay and apoptosis was analyzed by flow cytometry. Results The expression of miR-139-3p increased in gastric cancer compared with pericancerous tissues(P＜0.05).Expression of miR-139-3p was associated with tumor size（P＜0.05）and location（P＜0.05）. Down-regulation of miR-139-3p inhibited proliferation and promoted apoptosis of gastric cancer AGS and SGC-7901 cells. Conclusion miR-139-3p is up-regulated in gastric cancer,which might be involved in the development of gastric cancer.