胃癌組織中Syk基因甲基化狀態及臨床意義

呂萍 余江流 韓靜 余齊鳴 王實 鄭智國 凌志強

胃癌組織中Syk基因甲基化狀態及臨床意義

呂萍 余江流 韓靜 余齊鳴 王實 鄭智國 凌志強

目的 探討胃腺癌患者腫瘤組織、癌旁組織中Syk基因的甲基化狀態與臨床病理特征及預后的關系。 方法 應用Real-time甲基化特異性聚合酶聯反應技術(MSP)檢測92例胃腺癌患者腫瘤組織、配對的癌旁組織中Syk基因的甲基化狀態，并分析其與臨床病理因素及預后之間的關系。選取40例年齡對應的健康志愿者及48例非萎縮性胃炎患者胃鏡獲取的組織DNA作對照。結果 胃腺癌患者腫瘤組織中檢測到Syk基因甲基化有33.7%(31/92)，明顯高于癌旁組織5.4%(5/92)。健康對照者和胃炎患者均無Syk基因甲基化。Syk基因甲基化與腫瘤大小、生長方式、分化程度、是否有靜脈或淋巴管侵犯、TNM分期有關（P＜0.05）。 結論 胃腺癌患者Syk基因甲基化與腫瘤的生物學行為有關，提示腫瘤進展，預后不佳。

胃癌 Syk基因 DNA甲基化

既往研究發現，脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine of kinase，Syk）是一種候選抑癌基因，Syk基因失活與消化道腫瘤、鼻咽癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤的發生、發展有關[1-3]。故推測Syk基因DNA甲基化失活可能在胃癌中也扮演重要角色，但關于Syk基因甲基化與胃癌關系的研究鮮有報道。本研究檢測了92例胃癌患者癌組織、癌旁組織中syk的甲基化狀態，以探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集浙江省腫瘤醫院2008-01—2009-12的92例診胃腺癌患者的癌組織及癌旁組織，所有病例均經術前胃鏡活檢病理確診，術后組織標本經病理切片診斷證實為胃腺癌。術前未接受放、化療。其中男53例、女39例，年齡36～73歲，平均53.9歲。腫瘤位置：胃底賁門30例，胃體31例，胃竇31例；腫瘤直徑＜5cm者60例，≥5cm者32例。高、中分化腺癌62例，低分化腺癌30例；腫瘤生長方式：膨脹型20例，浸潤型72例。Hp感染42例，Hp未感染50例。按照2010NCCN指南pTNM分期標準進行術后病理分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期29例，Ⅲ期37例，Ⅳ期9例。所有患者均由專人進行術后跟蹤隨訪，具有完整的隨訪資料，以腫瘤復發轉移或死亡為隨訪終點事件，統計無進展生存期，隨訪截止于2011-06。同期選取88例胃鏡檢查已排除惡性腫瘤者作為對照組，其中40例為健康志愿者，男24例，女16例；48例為非萎縮性胃炎患者，男30例，女18例。本研究經浙江省腫瘤醫院倫理委員會批準，經患者同意并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 患者手術切除標本后，即由專人負責收集標本組織。癌組織標本取自癌灶，癌旁組織距腫瘤邊緣約5cm。對照組為胃鏡活檢組織。切取后立即置于液氮中保存。采用經典苯酚、氯仿方法按MagaBio試劑盒說明書提取基因組DNA，并置于-20℃保存[4]。

1.2.2 DNA亞硫酸氫鹽修飾 修飾前先用紫外分光光度計測定DNA濃度及純度，吸光度值（A）260/（A）280比值≥1.8的DNA為合格樣本。基因組DNA亞硫酸氫鹽修飾及純化按EpiTect Bisulfite試劑盒（Qiagen）說明書進行操作。

1.2.3 實時定量MSP分析標本甲基化狀態 根據Syk基因序列設計其5′-CpG島特異的甲基化和非甲基化引物如下：Sky_M（F）:5′-CGATTTCGCGGGTTTCGTTC-3′，Sky_M（R）:5′-AAAACGAACGCAACGCGAAA C-3′，擴增產物為243bp；Sky_U（F）:5′-ATTTTGTGGGTTTTGTTTGGTG-3′，Sky_U（R）:5′-ACTTCCTTAACACACCCAAAC23′，擴增產物為140bp。所有引物由Invitrogen公司合成。PCR反應體系20μl，在ABI7500PCR儀（美國ABI公司）上進行實時熒光MSP分析。反應條件：95℃預變性10min；95℃變性15s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共40個循環；72℃延伸10min。檢測啟動子區域5′-CpG位點是否處于甲基化狀態。對每個樣本的甲基化、非甲基化引物進行定量分析，根據所測CT值通過標準曲線計算各樣本DNA甲基化的拷貝數。甲基化百分率計算公式如下：甲基化百分率（M%）=100×（甲基化DNA拷貝數/靶基因DNA總拷貝數）。靶基因DNA總拷貝數=甲基化DNA拷貝數+非甲基化DNA拷貝數。M%＜20.0%為0分，20.0%≤M%＜40.0%為1分，40.0%≤M%＜60.0%為2分，60.0%≤M%＜80.0%為3分，M%≥80.0%為4分；0分定義為非甲基化、1～3分為部分甲基化，4分為完全甲基化。PCR反應結束后由熔解曲線判定擴增結果:其中出現甲基化擴增信號,而沒有非甲基化信號的判定為甲基化（M）；出現非甲基化產物信號而沒有甲基化產物信號的判定為非甲基化（U）；同時出現甲基化和非甲基化產物信號的判定為半甲基化（UM）。用在體外經SssI甲基轉移酶處理過的人類基因組DNA（NEB公司）作為陽性對照、未處理的正常人外周血DNA作為陰性對照,蒸餾水代替模板作為空白對照。

1.3 統計學處理 使用SPSS18.0統計軟件，計數資料各組間率的比較采用χ2檢驗、似然比χ2檢驗或Fisher確切概率法。生存曲線繪制用Kaplan-Meier法，終點事件為腫瘤惡化或患者死亡，觀察無進展生存期。生存曲線比較用Log-Rank檢驗，采用Cox比例風險模型進行多因素生存分析。

2 結果

2.1 Syk基因甲基化發生率 92例胃腺癌組織、配對的癌旁組織，40例健康志愿者及48例非萎縮性胃炎患者組織中Syk基因啟動子區域CpG島甲基化發生率分別為 33.7%（31/92）、5.4%（5/92）、0%（0/40）、2.1%（1/ 48）。胃腺癌組與其余3組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.2 Syk甲基化與胃腺癌臨床病理特征的關系 Syk基因啟動子區域的甲基化狀態與腫瘤大小、生長方式、分化程度、浸潤深度、是否有靜脈或淋巴管侵犯、是否存在淋巴結轉移和TNM分期有關（均P＜0.05），與患者的年齡、性別、腫瘤生長部位及有否Hp感染無關（均P＞0.05），見表1。

2.3 胃腺癌組織中Syk基因甲基化狀態與患者預后的關系 隨訪至第28個月時31例Syk甲基化患者中30例均出現疾病進展或死亡，其中13例甲基化4分者有8例死亡，5例腫瘤進展惡化；4例3分者有1例死亡，3例惡化；14例1～2分者有1例死亡，12例疾病進展。61例Syk非甲基化患者中14例有疾病進展，兩者差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。但是將Syk甲基化納入以上病理特征的Cox比例風險模型中，胃癌組織Syk甲基化不能作為影響胃癌患者術后生存的獨立預后因素。

3 討論

胃癌的發生和轉移是多基因和表觀遺傳學共同起作用的結果，抑癌基因的甲基化失活是最主要的表觀遺傳學修飾方式之一。Syk作為公認的候補抑癌基因，與T細胞激活中的ZAP-70屬于同一個蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）家族，位于人類染色體9q22上[5]。DNA甲基化導致Syk表達缺失，機體B細胞激活信號轉導失控，失去對腫瘤的正常免疫，從而使腫瘤發生發展。本研究表明，浸潤性生長的腫瘤比膨脹性生長的腫瘤Syk的甲基化程度高，低分化的胃腺癌組織較高、中分化者甲基化程度高，癌組織浸潤越深甲基化程度越高。同時Syk甲基化與淋巴結侵犯、靜脈侵犯、腫瘤大小也相關。表明Syk基因的甲基化與胃癌的分期、進展有關，Syk的甲基化程度高者，腫瘤分期晚，病情容易進展。然而，Cox比例風險模型表明，Syk甲基化程度不是胃癌的獨立預后因素，與以往研究[6]相符。要作為胃癌的預測因子，尚需結合其它的基因甲基化情況，如TIMP-3、CDH1、p16等等，多基因甲基化在胃癌的發生中是一早發事件[4，7]，建立胃癌相關基因的甲基化譜用于早期診斷和指導預后是未來發展方向。

表1 Syk基因甲基化與臨床病理特征的關系（例）

圖1 Syk基因甲基化與非甲基化胃癌患者生存曲線

本研究從生存曲線比較，Syk甲基化患者的胃癌術后無病生存率明顯低于非甲基化患者。且甲基化4分的患者病死率高于1～3分的患者，從一定意義上反映了Syk甲基化程度與胃癌患者的病死率有關，但需加大樣本量進一步驗證。國外研究資料[6]也發現細胞核Syk表達的胃癌患者5年存活率高于Sky不表達的患者。

綜上所述，胃癌組織中Syk基因啟動子區域異常甲基化一定程度上提示腫瘤的分化低分期晚，有轉移，可反映疾病進展程度，提示預后不佳。是否能通過抑制Syk及其它抑癌基因的甲基化達到治療或改善胃癌的預后[8]，尚需進一步研究說明。

[1]Kanwal S,Kayani M A,Faryal R.Identification of novel SNPs in SYK gene of breast cancer patients:computational analysis of SNPs in the 5'UTR[J].Mol Biol Rep,2012,39(8):8345-8351.

[2]Du Z M,Kou C W,Wang H Y,et al.Clinical significance of elevated spleen tyrosine kinase expression in nasopharyngeal carcinoma[J].Head Neck,2012,34(10):1456-1464.

[3]Zhao S,Sun G,Tony P W,et al.Expression and methylation status of the Syk gene in cervical carcinoma[J].Arch Gynecol Obstet,2011,283(5):1113-1119.

[4]羅君,王新保,余齊鳴,等.胃癌患者術前腹腔沖洗液中CDH1甲基化狀態及其臨床意義[J].中華胃腸外科雜志,2012,15（7）:64-68.

[5]Turner M,Mee P J,Costello P S.Perinatal lethality and blocked B-cell development in mice lacking the tyrosine kinase Syk[J].

Nature,1995,378(6554):298-302.

[6]Nakashima H,Natsugoe S,Ishigami S,et al.Clinical significance of nuclear expression of spleen tyrosine kinase (Syk)in gastric cancer[J].Cancer Lett,2006,236(1):89-94.

[7]Kang G H,Shim Y H,Jung H Y,et al.CpG island methylation in premalignant stages of carcinoma[J].Cancer Res,2001,61(7): 2847-2851.

[8]Ding Y B,Xia J G,Chen G Y.Effect of spleen tyrosine kinase expression re-activation by inhibition of DNA methylation on oncogenesis growth of gastric cancer[J].Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi,2006,9(6):523-526.

Objective To investigate the aberrant methylation of Syk gene in gastric adenocarcinoma and its clinical significance. Methods Real-time methylation-specific polymerase chain reaction (qMSP)was used to examine the methylation status of Syk gene in gastric adenocarcinoma tumor tissue and paired pericancerous gastric mucosa of 92 patients with gastric cancer.The relationship of Syk gene methylation and clinicopathologic features and prognosis of patients was analyzed.Forty age-matched healthy subjects and 48 patients with non-atrophic gastritis served as controls. Results The Syk gene methylation was detected in 31/92(33.7%)cases of gastric adenocarcinoma,which was significantly higher than that in pericancerous mucosa;no methylation was detected in gastric tissue from healthy controls and gastritis patients.Syk gene methylation status were correlated with tumor size,grow pattern,pathological differentiation，TNM stage and invasion of vein and lymphatic vessels (P＜0.05). Conclusion Ectopic methylation of Syk gene is associated with biological behavior of tumor in gastric adenocarcinoma,which may indicates tumor progression and poor prognosis.

Gastric cancerSyk gene DNA methylation

2012-10-11）

（本文編輯：胥昀）

浙江省科技計劃資助項目（2009C33143）；浙江省醫藥衛生平臺骨干人才計劃項目（2011RCA009）

325035 溫州醫學院第一臨床醫學院（呂萍、凌志強、余江流、韓靜，呂萍系在職碩士研究生，現在舟山婦幼保健院工作，凌志強系溫州醫學院碩士生導師）；浙江省腫瘤醫院腹部腫瘤外科（余齊鳴），內鏡中心（王實），浙江省腫瘤研究所（鄭智國、凌志強），

凌志強，E-mail:lingzq@hotmail.com