鴨傳染性漿膜炎檢測技術研究進展

劉 偉黃 瑜

（1.福建農林大學動物科學學院 福州 350000；2.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013）

鴨傳染性漿膜炎最早發現于美國的紐約，其后在英國、加拿大等國發生，我國于1982年首次報道該病的存在，是危害養鴨業的主要細菌性傳染病之一。臨診表現為困倦，眼與鼻孔有分泌物，排白色黏稠樣糞便，神經癥狀如共濟失調、抽搐、頭頸震顫等，慢性病例可見斜頸。病理變化特點為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎。臨診中該病易與鴨大腸桿菌病混淆，建立快速、及時、準確的檢測方法具有重要意義，有助于治療藥物的選擇，減少經濟損失。本文就鴨傳染性漿膜炎檢測技術的發展進行綜述。

1 傳統的鴨傳染性漿膜炎檢測方法

1.1 病原的分離鑒定 初次分離時無菌采取病死鴨心血、肝臟或腦組織，在巧克力培養基和胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）平板上劃線，在含有二氧化碳的環境中培養，平板上會長出表面光滑的菌落，稍突起，圓形，直徑1～1.5 mm，若繼續培養菌落可達2 mm。鴨疫里默氏菌不能在普通瓊脂和麥康凱培養基上生長，在血瓊脂上不產生溶血。該菌革蘭氏染色為陰性小桿菌，無芽孢，有莢膜，瑞氏染色為兩極濃染。

細菌的分離鑒定需要時間較長，一般為2～3 d，并且費時費力，不適于常規的臨床診斷，也不適合于大規模集約化生產中鴨疫里默氏菌病的檢測。

1.2 生化試驗 該菌不發酵碳水化合物，但少數菌株能發酵葡萄糖、果糖、麥芽糖或肌醇，不產生吲哚和硫化氫，不還原硝酸鹽，不產生靛基質和硫化氫，可液化明膠，接觸酶試驗和尿素酶分解皆為陽性，西檬氏枸杞酸鹽利用陰性，氧化酶、過氧化氫酶、磷酸酶陽性。

1.3 血清學檢測方法

1.3.1 平板凝集試驗 將陽性血清（適當稀釋）與待檢菌懸液各一滴滴在玻片上混合，數分鐘后，出現顆粒狀或絮狀沉淀者為陽性。該試驗用于鴨疫里默氏菌的血清型初步鑒定，操作簡便快速。但敏感性較低，還有可能發生不同血清型間的交叉反應。

1.3.2 試管凝集試驗 用來檢測血清中是否存在相應抗體，測定抗體的效價，也用于對玻片凝集試驗中表現交叉反應的分離株進行進一步的檢測以及明確各型標準菌株之間的抗原關系［1］。操作簡單快速，敏感性較低。

1.3.3 間接血凝試驗 高福等［2］報道了用瓊脂擴散抗原致敏戊二醛化的綿羊紅血球來檢測血清中RA抗體，初步證明其敏感性較高。

1.4 瓊脂凝膠擴散試驗 利用可溶性抗原和抗體在半固體凝膠中進行反應，當抗原抗體分子相遇并達到相應比例時，就會相互結合，凝集，出現白色的沉淀線，從而判定相應的抗原和抗體。該試驗用于鴨疫里默氏菌的血清型初步鑒定，敏感性也較低。

1.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 檢測抗體常用的方法之一，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，相對于凝集試驗和沉淀試驗，ELISA具有更高的敏感性，從而適合于對血清中的RA抗體效價進行檢測［1］。

Hatfie1d等（1987）建立了用ELISA方法來檢測鴨血清中抗RA抗體，但其抗原為2型RA的裂解菌體，并且應用了酶標記驢抗兔IgG，操作步驟和試驗結果判定都較為復雜。

張鶴曉等［3］用裂解的1型RA菌體作為包被抗原，建立了特異性強，重復性良好且敏感性高的檢測鴨血清中RA1型抗體的ELISA方法。該方法可作為鴨傳染性漿膜炎感染的血清流行病學調查和對其疫苗免疫效果評價。方法如下：制備RA抗原，自制陽性血清和陰性血清，酶標兔抗鴨IgG的制備，底物溶液的配制，洗滌液中NaC1濃度對非特異性吸附影響的測定，進行ELISA。

蘇敬良等［4］、程龍飛等［5］、程安春等［6］又分別建立了檢測2型、3型、4型RA抗體的ELISA方法。Huang等［7］以 RA15型的OmpA 基因（P45）編碼 N-端的41 ku蛋白的編碼區進行重組表達的蛋白建立間接ELISA方法，可以對多種RA的早期感染進行有效的檢測。辜新貴等［8］根據克隆的RA1型的一種“保守的假定蛋白（conserved hypothetica1protein）”基因（ P25）（ GenBank Accessio No：EU072443）進行重組表達，建立以重組P25蛋白為包被抗原的間接ELISA。P25蛋白是各種血清型RA間的共同抗原，所建立的ELISA可用于檢測不同血清型RA的感染。

1.6 免疫熒光技術 熒光免疫技術是將抗原抗體反應的特異性與熒光技術的敏感性相結合，對抗原或抗體進行定性、定位或定量檢測。該技術具有簡便、快速、敏感和特異性強等特點。檢測時取病料涂片、固定、然后進行特異熒光染色、最后鏡檢，熒光著染的RA在黑暗的背景中呈橢圓形亮黃綠色環狀結構，而大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌均不被熒光著染，整個視野暗淡、只隱約見到灰暗色的菌體［1］。該檢測方法快速、準確的區分大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和沙門氏菌。Marshe11最早報道了用該技術檢查患鴨組織或滲出物中的RA［1］。

免疫熒光技術檢測鴨疫里默氏菌病可分為直接熒光抗體技術和間接熒光抗體技術。郭玉璞等采用直接熒光抗體法來診斷急性病例。蘇敬良等［9］將間接熒光抗體技術用于急性死亡病例的檢測。朱琪等建立了間接免疫熒光抗體試驗，對鴨疫里默氏菌病等進行鑒別。張大丙等［1］的研究結果表明，直接和間接熒光抗體試驗均無型特異性，卻均有種特異性，因此，都可用于菌種的鑒定，但在兩種試驗中，都以同型抗原抗體之間出現較強的熒光，而異型之間出現的熒光易衰減［1］。

2 分子生物學檢測方法

分子生物學檢測相對于傳統的檢測方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、快速等優點。

2.1 PCR技術 PCR（聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外95℃時解旋，35℃時引物與單鏈按堿基互補配對結合，再調溫度至65℃左右DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互補鏈。RA的血清型十分復雜，目前全世界已報道的血清型有21個，不同血清型之間沒有交叉保護作用。由于PCR方法并不針對病原菌的血清型，因此，能夠彌補血清型之間交叉反應性低或沒有交叉反應性的不足［10］。

胡清海等首先建立了PCR檢測鴨疫里默氏菌病的方法［11］。楊建遠等［12］設計了特異性引物，建立了鴨疫里默氏菌病的快速準確的PCR檢測方法。其研究根據GenBank中25株鴨疫里默氏菌（RA）的外膜蛋A（OmpA）基因序列，在其高度保守區設計了一對特異性引物，該PCR檢測方法具有準確、可靠、快速、經濟之優點，可用于RA的臨床檢測和流行病學調查。曲豐發等［13］以16SrDNA為靶基因建立特異性PCR快速檢測鴨疫里默氏菌的方法具有較好的特異性和敏感性。覃宗華等［14］采用細菌16SrRNA基因的通用引物，用PCR方法擴增出鴨疫里默氏菌的部分16SrRNA基因，同時利用生物軟件對Gen－Bank收錄的鴨疫里默氏菌和大腸桿菌16SrRNA基因序列進行分析后，設計了鴨疫里默氏菌和大腸桿菌的種特異性引物，并據此建立了一種能快速準確鑒別診斷鴨疫里默氏菌病和大腸桿菌病的雙重PCR方法。

PCR檢測除16SrRNA基因序列分析法和外膜蛋白分析法外，還有RFLP和REP-PCR分析法。

2.2 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR技術（Rea1-Time Quantitative PCR）是近年發展起來的一種高敏感性檢測技術，它在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR技術放大檢測了信號，提高了檢測的敏感性；熒光定量PCR具有引物和探針的雙重特異性，故與傳統的PCR相比，特異性大為提高；熒光定量PCR結果相當穩定，無PCR后續操作步驟，降低產物污染的風險性，假陽性結果幾率降低。熒光定量PCR分DNA熒光結合染料法和特異性熒光探針法，熒光探針法特異性較高。

段澤等［15］根據其實驗室發現的鴨疫里默氏菌（RA）莢膜多糖蛋白基因序（DQ151838），設計和合成熒光定量PCR引物和探針，建立了檢測RA的實時熒光定量PCR方法。可用于鴨疫里默氏菌感染的快速診斷、流行病學調查和鴨產品的檢疫等。

謝永平等［16］的研究根據GenBank登錄的鴨疫里默氏菌外膜蛋白（OmpA）基因保守區序列，設計引物和探針，建立了直接檢測鴨疫里默氏菌的實時熒光定PCR快速方法。該方法應用熱裂解法快速提取病料中RA中的DNA，與常規試劑提取方法比較，僅需30 min，縮短了DNA提取時間，應用建立的實時熒光定量PCR檢測臨床樣品，完成檢測僅需2 h，與試劑提取DNA方法需要5 h比較，顯著縮短了檢測周期，為臨床診斷RA提供了快速檢測方法，適用于臨床鴨疫里默氏菌病的快速檢測。

馮金牛等［17］根據RA的16SrRNA基因的保守序列設計了特異性引物和TaqMan探針，建立了檢測RA的實時熒光定量PCR方法。該方法只對RA的DNA有陽性擴增信號，對 E.coli、P.multocida、Salmonella均無特異性反應。所建立的FQ-PCR方法具有良好的穩定性和重復性，標準曲線相對理想，具有較好的實用性，所建立方法的敏感性和特異性均高于普通PCR，且省時省力。

3 小結

鴨疫里默氏菌病是目前我國危害養鴨業最重要的傳染病之一，使我國養鴨戶遭受重大的經濟損失，嚴重阻礙了中國養鴨業的發展。以上是鴨疫里默氏菌病的檢測方法，各有特點，希望以后能有更多更好的檢測方法應用于鴨疫里默氏菌病的檢測之中。

［1］ 張大丙，鄭獻進，曲豐發.鴨傳染性漿膜炎的診斷與防治技術［J］.中國家禽，2005，27（6）：46-52.

［2］ 高福，楊漢春，郭玉璞.第18屆世界家禽會議分組討論議會國際水禽生產學術會議論文集［C］.北京，1988：261-262.

［3］ 張鶴曉，郭玉璞.間接ELISA檢測鴨疫里氏桿菌抗體的研究［J］.中國畜禽傳染病，1998，20（3）：183-186.

［4］ 蘇敬良，郭玉璞，呂艷麗.鴨疫里默氏桿菌免疫原性研究Ⅱ莢膜提取物免疫原性測定［J］.中國獸醫雜志，1998，24（8）：3-5.

［5］ 程龍飛，施少華.2型鴨疫里氏桿菌抗體間接ELISA檢測方法的建立與應用［J］.福建農業學報，2006，21（2）：131-134.

［6］ 程安春，汪名書.簡介酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測4型鴨疫里氏桿菌抗體的研究［J］.中國家禽，2004，26（16）：11-14.

［7］ HUANG B，SUBRAMANIAM S，FREY J，et a1.Vaccination of duckswith recombinant outer memb rane protein（Ompa）and a 41 Kda partia1 protein （P45N’）of Riemere11a anetipestife ［J］.Vet Microbio1，2002，84（3）：219-230.

［8］ 辜新貴，袁建豐，覃宗華，等.鴨疫里默氏桿菌重組蛋白P25間接ELISA檢測方法的建立［J］.中國獸醫科學，2008（3）：218-223.

［9］蘇敬良，黃瑜，呂艷麗，等.間接熒光抗體技術檢測鴨疫里氏桿菌［J］.中國獸醫雜志，1999，25（2）：12-13.

［11］ 張金靈，劉亞剛，吳皎，等.鴨傳染性漿膜炎研究進展［J］.西南民族大學學報自然科學版，2006，32（4）：735-741.

［12］ 楊建遠，鄧舜洲，何后軍.PCR法快速檢測鴨疫里氏桿菌的研究［J］.江西農業大學學報，2005，27（3）：439-442.

［13］ 曲豐發，蔡暢，鄭獻，等.利用16SrDNA建立種特異性快速檢測鴨疫里默氏菌［J］.微生物學報，2006，46（1）：13-17.

［14］ 覃宗華，蔡建平，呂敏娜，等.鴨疫里默氏茵病和大腸桿菌病鑒別診斷雙重PCR方法的建立和應用［J］.畜牧獸醫學報，2008，39（4）：517-521.

［15］ 段 澤，程安春，汪銘書，等.實時熒光定量PCR檢測鴨疫里默氏桿菌方法的建立和應用［J］.中國獸醫雜志，2008，44（2）：11-15.

［16］ 謝永平，盤寶進，陳澤祥，等.鴨疫里默氏桿菌實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立與應用研究［J］.中國畜牧獸醫，2010，37（10）：87-92.

［17］ 馮金牛，陳芳艷，晏永邦，等.鴨疫里默氏桿菌熒光定量PCR 檢測方法的建立［J］.中國獸醫科學，2011，41（4）：392-396.