結核分枝桿菌(MTB)異質性耐藥研究進展

柳清云 孫 剛 高 謙

(復旦大學上海醫學院生物醫學研究院 醫學分子病毒學教育部/衛生部重點實驗室 上海 200032)

20世紀40年代以來，鏈霉素、異煙肼、利福平等抗結核藥物的廣泛使用，使結核病的發病率和死亡率一度大幅下降［1］。但由于耐藥結核，特別是耐多藥結核(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結核(extensivelydrug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的出現，給結核病的防控帶來了嚴峻的挑戰。據世界衛生組織(WHO)統計，2011年全球約有31萬MDR-TB，其中約9%為XDR-TB，中國是全世界結核病第二高負擔國家，MDR-TB病例數居世界首位［2］。

結核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis，MTB)主要通過藥物結合位點或藥物活化基因等特定基因組區域的突變獲得可穩定遺傳的耐藥基因型。例如，利福平耐藥性是由于RNA聚合酶β亞基編碼基因(rpoB)耐藥決定區的點突變引起［3］，異煙肼耐藥性主要由過氧化氫-過氧化物酶編碼基因(katG)的突變導致［4］。通過檢測這些基因的耐藥相關突變，可以預測MTB的耐藥情況。在檢測臨床分離培養的樣本時，經常會發現敏感菌株和耐藥菌株共存的現象，即異質性耐藥［5］。異質性耐藥因為影響藥敏結果以及治療方案的正確判斷和評估而逐漸受到人們的重視。本文將對目前結核分枝桿菌異質性耐藥的產生及其對臨床的影響進行綜述。

異質性耐藥的產生 早在抗結核藥應用之初，研究者就發現MTB存在異質性耐藥的現象。由于MTB存在自發突變，即使是對藥物敏感的MTB群體中也含有低頻率(10－9～10－8)的耐藥菌［6］，但此時耐藥菌的頻率過低無法檢測，沒有臨床意義。抗結核治療開始后，MTB群體中的敏感菌被逐漸殺死，耐藥菌的頻率逐漸上升，當達到臨界值即被診斷為耐藥結核病。由此可見，異質性耐藥反映了MTB群體從部分耐藥向全部耐藥轉變的中間過程，耐藥性的定義也取決于耐藥菌在樣本中被檢測到的頻率。由于藥敏測試方法的不同，其檢測靈敏度也各不相同。Canetti等［7］于1969年總結了當時3種主流的藥敏測試方法(絕對濃度法、耐藥-比率法和比例法)的靈敏度、特異性和操作難易度等特點，建議以比例法作為MTB藥敏測試的標準。WHO的結核病指南采納了這一建議，規定當耐藥菌的頻率高于1%時(這一數值遠高于MTB的自發突變頻率)，即可診斷為有臨床意義的耐藥結核病［8］。這種以細菌在含藥培養基中是否生長作為判斷耐藥標準的方法稱為表型耐藥檢測，是目前耐藥檢測的金標準。

隨著對MTB耐藥機制的深入了解，通過檢測耐藥相關突變可以預測細菌的耐藥性，即基因型耐藥。在臨床檢測中，常會出現基因型耐藥和表型耐藥檢測結果不一致或從同一樣本中同時檢出耐藥基因型和敏感基因型的現象，提示異質性耐藥的存在對基因型耐藥檢測結果有影響［5，9］。Rinder等［5］用 PCR和克隆方法對臨床MTB異質性耐藥進行了評估，通過檢測異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇3種藥物的耐藥相關基因，發現分別有5/16、3/17、1/20的臨床樣本中同時存在攜帶耐藥突變和沒有耐藥突變的MTB。Tolani等［10］用 GenoType MTBDRplus檢測發現利福平耐藥菌株中rpoB耐藥異質性達34%(22/64)，異煙肼耐藥菌中異質性耐藥更高達65．7%(23/35)。此外，二線抗結核藥物的耐藥菌株中也存在異質性耐藥。Chakravorty等［11］用分子信標檢測技術發現韓國19．0%(8/42)的喹諾酮耐藥為異質性耐藥。Zhang等［12］用PCR擴增克隆并測序DNA旋轉酶α亞基(gyrA)基因耐藥決定區發現23%(54/235)的喹諾酮耐藥菌株為異質性耐藥。Streicher等［13］對氧氟沙星和阿米卡星耐藥耐藥基因作直接測序，發現異質性耐藥在兩種耐藥菌中的比例分別為25%和 16．3%。

異質性耐藥的現象促使人們研究耐藥MTB的產生和發展過程。MTB耐藥突變數據庫(TBDReaMDB)的記錄顯示與同一種藥物耐藥相關的突變通常有多種甚至數十種［14］，而在臨床檢測中只發現其中的一至兩種。由此引出的問題是，這些突變是如何在細菌群體中被篩選出來的?通過對同一患者連續采樣，Mariam等［15］研究發現，在患者治療過程中，MTB群體對鏈霉素先后產生了4種不同的耐藥相關突變(編碼30S核糖體蛋白的基因rpsL的K87R和K42R突變，16S核糖體RNA rrsA513C和A1400G突變)，但在治療后期只有突變rpsL K42R在群體中被固定下來。本課題組Sun等［16］在近期的研究中用高通量測序技術更細致地研究了3例結核患者體內MTB異質性耐藥的發展過程。研究發現在異煙肼耐藥性產生的早期，同一細菌群體中存在4～5種與異煙肼耐藥相關的突變(katG V1A，D94N和S315R突變，inhA的C-15T)，這些突變的頻率之和接近100%，說明突變分布在不同的結核菌亞群中，幾乎沒有敏感菌存在。隨著治療進行，最終只有1種耐藥突變的細菌亞群(katG D94N)的頻率上升至主導地位(93．9%)，其他細菌亞群則逐漸消失，這提示攜帶不同突變的耐藥菌亞群之間存在相互競爭并最后篩選出優勢亞群。這種亞群間的相互競爭，又被稱為克隆干擾，其結果使適應性最強的耐藥結核菌脫穎而出［17］。

克隆干擾在亞群競爭中篩選出適應性較強的菌株，而適應性強的菌株可能通過兩種方式獲得，一種是不同耐藥突變本身對細菌的適應性強弱存在差異［18］;另一種是細菌通過額外的基因組的突變補償了由于耐藥突變造成的適應性下降，這種現象稱為補償性突變。Comas等［19］研究證實，MTB rpoA及rpoC基因上的特定突變補償了利福平耐藥突變帶來的適應性下降。我們課題組也發現，耐藥突變出現之后，另有11個非同義突變在治療過程中發生顯著性變化，其中的6個突變頻率在80%以上。這些突變所在的基因大多與細胞壁合成或跨膜轉運相關，提示可能與耐藥MTB的補償性機制相關［16］。

異質性耐藥對臨床耐藥檢測的影響 目前，用于檢測耐藥結核病的分子診斷技術主要有Xpert MTB/RIF、GenoType MTBDRplus、Sloppy Molecular Beacon、Sanger測序等［11，20－21］。這些技術能夠快速檢測臨床樣本中的耐藥突變，但對異質性耐藥樣本中耐藥突變的檢測靈敏度尚不能令人滿意［22－23］。Chakravorty 等［11，24］開 發 的 Sloppy Molecular Beacon方法可以檢測樣本中比例在40%以上的利福平耐藥突變和比例高于20%的喹諾酮耐藥突變。Sanger測序可以檢測出20%以上的耐藥突變［5］。由此可見，分子診斷技術目前還難以達到表型耐藥檢測方法對異質性耐藥的檢測靈敏度。

對異質性耐藥的檢測靈敏度低將影響分子診斷技術對耐藥結核病的預測率。在全球范圍內，不同地區的實驗室都存在基因型耐藥和表型耐藥檢測結果不符的現象，且對同種藥物耐藥預測率差異較大［25－26］。為了驗證了異質性耐藥對分子診斷技術預測率的影響，Streicher等［13］對171株氧氟沙星耐藥以及140株阿米卡星耐藥的樣本進行測序，發現分別有9和11個樣本的基因型耐藥與表型耐藥檢測結果不符，即在表型耐藥的菌株中未檢測到耐藥突變。但通過對耐藥菌株的耐藥相關基因克隆并測序后發現，其中7/9喹諾酮耐藥樣本以及11/11阿米卡星耐藥樣本都能檢測出gyrA或rrs突變。將這些異質性耐藥菌株納入考慮，該研究中耐藥基因型對耐藥表型的預測率將分別達到98．8%和100%。

當然，除異質性耐藥影響耐藥基因型對耐藥表型的預測外，其他的因素還包括:(1)未知或其他耐藥機制導致MTB耐藥，Takiff等［27］發現外排泵系統可介導喹諾酮低濃度耐藥，Zaunbrecher等［28］也發現氨基糖苷類乙酰基轉移酶編碼基因(eis)啟動子區的特定突變可導致卡那霉素低濃度耐藥;(2)體外培養可能導致耐藥菌亞群比例下降，低于其檢測靈敏度，Martin等［29］發現在體外培養中生長速率快的群體會掩蓋生長速率慢的群體，由于MTB耐藥性的產生通常伴隨著生長速率的下降，體外培養可能導致其在群體中的比例變小或者消失。

研究異質性耐藥的意義 研究異質性耐藥，首先加深了對耐藥結核病發生發展過程的認識。耐藥MTB的成功建立，需要MTB在自身群體達到相當數量，發生多種不同突變形式(包括多種耐藥突變)來應對抗生素壓力，并以相互競爭的方式選出適應性最好的攜帶耐藥突變的耐藥細菌亞群［16］。這一過程中決定耐藥突變種類的因素包括MTB在體內的復制時間，突變速率以及群體數量。由于細菌群體數量是決定自發突變數量的關鍵因素，因此在細菌群體數量較小的時候用藥治療，可以有效地降低耐藥細菌的產生，這為早期診斷技術的應用提供了理論依據［30］。目前臨床普遍采用的結核病診斷方法為顯微鏡檢測，其檢測的靈敏度需要在每毫升痰液中有10 000個細菌，而采用新的液體培養或GeneXpert分子檢測靈敏度可以到達每毫升痰液10～100個細菌，靈敏度提高了100～1 000倍［22］。因此，普及靈敏的早期診斷技術，有利于在體內菌載量較小的時候及早治療，這對于減少耐藥菌株的產生，特別是減少適應性高的耐藥菌的產生具有重要意義。

其次，檢測異質性耐藥對評估結核病治療方案和指導臨床用藥具有重要意義。由于異質性耐藥的原因，在低頻率的耐藥菌株存在時藥敏結果為敏感，而針對敏感菌株的治療方案最后可能由于耐藥菌株的比例逐漸增加而治療失敗。而目前對MTB異質性耐藥的認識還不深入，針對異質性耐藥是否需要采取不同的治療措施還有待探討。在腫瘤治療中，異質性的出現使抗腫瘤藥物只能殺傷部分腫瘤細胞，而小部分存活下來的耐藥腫瘤細胞則逐漸占據主體地位［31］。針對腫瘤的異質性耐藥，目前主要采取增加藥物劑量、靶向給藥等方案進行特殊化治療［32－33］。這些在腫瘤治療領域的研究經驗能否在結核病異質性耐藥的治療中得到借鑒，有待進一步的研究。

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