應用DIBA快速檢測番茄黃化曲葉病毒

季英華， 周曉偉， 張 暉， 周益軍

(江蘇省農業科學院植物保護研究所，江蘇 南京 210014)

番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)是番茄上一種毀滅性的病毒，分類上屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)，主要傳播介體為煙粉虱(Bemisia tobaci)。該病毒早在1964年以色列就有發生危害報道［1］，近年來，隨著全球氣候變暖和耕作制度的改變以及國際間貿易的增加，TYLCV在全球范圍傳播，給番茄等作物的生產造成了嚴重危害［2-3］。2006年TYLCV在上海和浙江等地陸續出現危害，隨后幾年迅速擴展至江蘇、安徽、山東、河南、河北、北京等地［4-8］。據各地植保部門的不完全統計，2009年中國番茄黃化曲葉病的年發生面積超過2.0×105hm2，遭受嚴重損失的面積在6.6×104hm2以上，經濟損失超過5.0×109元。

在TYLCV檢測上，比較常用的方法是基于PCR的分子檢測［9-10］，該方法具有靈敏度高，檢測時間相對較短等優勢，但存在設備要求高、操作繁瑣、成本較高等問題，很難應用于基層和大批量樣品的檢測，而病害的調查和預測預報往往需要檢測大量樣本，因此建立一種快捷、簡便、高效而又成本較低的檢測方法是一項迫在眉睫的任務。本研究擬建立一種基于DIBA(斑點免疫結合分析法)的TYLCV快速檢測方法，旨在為病害的預測預報及病害調查提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試番茄病樣為室內接種獲得的TYLCV病株，健康番茄材料為實驗室內培育的不含TYLCV番茄苗，田間樣品于2011年采自江蘇南京。

1.2 抗體和試劑

TYLCV單克隆抗體［11］由浙江大學周雪平老師提供;堿性磷酸酯酶(AP)標記的羊抗鼠IgG購自SIGMA;硝酸纖維素膜購自PALL;dNTP、Taq酶購自TaKaRa;顯色底物BCIP/NBT購自上海生工生物工程有限公司;其余試劑均為國產分析純。

1.3 DIBA 檢測方法［12］

(1)在硝酸纖維素膜上劃0.5 cm×0.5 cm方格，根據試驗樣品數裁剪，1個樣品用1個方格。(2)取植物樣品0.1 g，加1 ml碳酸鹽包被液，充分研磨;(3)低速離心3～5 min，取上清3～5 μl點膜，室溫晾干;(4)用含3%脫脂奶粉的PBST緩沖液37℃封閉45 min;(5)將膜浸入含有單抗的PBST緩沖液(含3%脫脂奶粉)中37℃孵育1.5 h;(6)PBST洗膜3～4次，每次5 min;(7)加入AP標記羊抗鼠IgG(含3%脫脂奶粉的PBST緩沖液1∶6 000稀釋)，37℃孵育1.5 h;(8)PBST洗膜3～4次，每次5 min;(9)將膜浸入顯色底物BCIP/NBT中充分顯色;(10)加雙蒸水終止反應，觀察記錄結果。

1.4 單抗作用濃度的優化

單抗按1∶3 000、1∶5 000、1∶8 000、1∶15 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000及1∶160 000稀釋構建濃度梯度，DIBA檢測后，根據試驗結果選擇最佳單抗濃度。

1.5 靈敏度檢測

將植物樣品研磨勻漿后得到的原液［鮮重(g)∶包被液(ml)=0.1∶1.0］按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶ 3 200、1∶6 400、1∶ 12 800、1∶ 25 600 及1∶51 200稀釋構建濃度梯度，方法參照方法1.3，單抗濃度參照方法1.4，測定建立的DIBA方法檢測樣品的靈敏度，設3次重復。

1.6 準確性檢測

對實驗室內保存的確認感染TYLCV的番茄樣品和健康番茄樣品共抽選10份，分別用PCR方法［6］和DIBA檢測，單抗濃度參照方法1.4，每個樣品重復2次。根據兩種方法的檢測結果來評估建立的DIBA檢測方法的準確性。

1.7 穩定性檢測

利用已建立的DIBA檢測方法，對同一批番茄樣品(同時含有陽性和陰性)進行3次重復檢測試驗，每次重復中，每個樣品研磨后在膜上重復點膜3次，根據3×3次重復的結果來判定檢測方法的穩定性。

1.8 田間樣品檢測

大田隨機采樣，利用建立的DIBA方法對采集樣品進行檢測，根據檢測結果來檢驗建立的DIBA方法對田間樣品的檢測能力。

2 結果

2.1 最適單抗濃度優化

在其他條件不變的前提下，對單抗進行稀釋，發現當單抗稀釋度在1∶3 000～1∶20 000時，利用DIBA方法可以很明顯地區分樣品，只是稀釋度在1∶3 000時，陰性樣品有少許顯色。當單抗稀釋到1∶40 000及以上時，陽性樣品雖然也有顯色，但是顯色不明顯。因此理論上單抗的稀釋范圍可以為1∶3 000～1∶20 000，推薦使用 1∶5 000～1∶15 000，本研究后續試驗單抗稀釋度采用1∶8 000。

2.2 靈敏度檢測

將植物樣品處理后的原液(鮮重(g)∶包被液(ml)=0.1∶1.0)進行稀釋，對稀釋樣品進行檢測，結果顯示:在3次重復中，原液稀釋到1∶800時，陽性樣品還可以看到非常淡的顯色，稀釋到1∶1 600時基本上看不見顯色，所以推測單抗檢測植物樣品的極限是1∶800，在檢測樣品時推薦采用原液或者原液稀釋50倍。

2.3 準確性檢測

對實驗室內保存的感染TYLCV的番茄樣品和健康番茄樣品進行抽樣檢測，PCR檢測結果顯示10份樣品中有6份樣品為陽性;利用DIBA也檢測到了6份，并且與PCR檢測結果完全一致，說明建立的DIBA方法可以較準確地檢測TYLCV。

2.4 穩定性檢測

從實驗室內保存的感染TYLCV的番茄樣品和健康番茄樣品中抽選8份進行DIBA檢測，結果同一樣品3次重復檢測試驗顯色一致，同一樣品研磨后3次重復點膜顯色也一致，說明建立的DIBA方法檢測TYLCV具有較好的穩定性。

2.5 田間樣品檢測

對2011年采自江蘇南京日光溫室的30份番茄樣品進行檢測，結果也表明建立的DIBA檢測方法可以對田間樣品進行有效檢測。

3 討論

對于TYLCV的檢測方法，前人有很多報道，包括血清學、PCR 檢測、核酸雜交檢測等［9，13-16］，但是 DIBA 檢測方法對于檢測大批量樣品有其無可比擬的優勢。

在利用DIBA檢測樣品時，若直接采用原液(不稀釋)，有時會有色素或雜質影響，建議在對粗樣低速離心時適當延長離心時間或者選擇相對較高的離心速度，這樣可以較好地減少色素或雜質的影響。雖然本試驗結果表明單抗稀釋度在1∶3 000～1∶20 000時也能顯色，但是在檢測大量樣品時推薦使用1∶5 000或者 1∶8 000稀釋度，這樣能較好地兼顧穩定性和靈敏度。很多研究結果顯示大多數雙生病毒的增殖部位局限于植物韌皮部組織［17-19］，我們在利用單抗對番茄不同部位的TYLCV進行Western-blot分析時也發現:韌皮部病毒的含量最高，推測檢測時取樣的最佳部位應該是韌皮部，但是韌皮部在檢測時候會存在一些問題，比如采樣不方便、樣品處理較費時，因此本方法還是采用番茄葉片作為取樣部位進行檢測，該方法也同樣適用于韌皮部組織的樣品檢測，而且可能會有更高的靈敏度。在檢測大量樣品時，比較DIBA與PCR的檢測結果，有時會發現它們存在一些差異，這可能與二者的檢測靈敏度、特異性等因素相關，但從目前我們對江蘇及周邊地區的樣品檢測結果來看，二者還是基本一致的。

在菜豆金色花葉病毒屬中，與TYLCV序列接近的病毒有多種，利用單抗進行檢測時也可能會檢測到一些近緣的病毒，因此，田間調查時建議采用兩步法:第一步，先DIBA檢測;第二步，抽選DIBA檢測結果中的陽性樣品進行PCR檢測。這樣既提高了樣品的檢測量，又保障了樣品檢測的準確性。對于目前只有TYLCV發生地區，如江蘇、安徽、山東等地，只用DIBA檢測方法來檢測TYLCV是可行的，同時也建議抽樣進行PCR檢測，以防有新病毒傳入。

致謝: 本研究所用TYLCV單克隆抗體由浙江大學周雪平老師提供，在此表示衷心感謝!

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