微擬球藻屬對(duì)鹽度的耐受及其產(chǎn)油特性分析

黃偉超胡晗華

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

微擬球藻屬對(duì)鹽度的耐受及其產(chǎn)油特性分析

黃偉超1,2胡晗華1

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

微擬球藻(Nannochloropsis)是一類屬于真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)、球形或近似球形的單細(xì)胞真核生物,其細(xì)胞小(通常2—4 μm), 形態(tài)簡(jiǎn)單, 僅憑形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)很難確定其分類地位。然而, 與其他真核微藻顯著不同的是, 該屬的種類除葉綠素a外, 并不含有其他類型的葉綠素[1]。自Hibberd[2]首先描述微擬球藻屬以來,該屬大約有6個(gè)已定種, 分別是: 加的斯微擬球藻(N.gaditana)、顆粒微擬球藻(N.granulata)、湖泊微擬球藻(N.limnetica)、海洋微擬球藻(N.oceanica)、眼點(diǎn)微擬球藻(N.oculata)和鹽生微擬球藻(N.salina)。該屬的種類多為海生或鹽生[3], 但也常見于淡水環(huán)境中[4]。由于微擬球藻屬的種類含有高的多不飽和脂肪酸, 特別是二十碳五烯酸(EPA),而被認(rèn)為是工業(yè)化生產(chǎn)EPA的最佳原料[5]。此外, 微擬球藻還能作為魚類幼體和輪蟲的餌料甚至是人類的食品。

自20世紀(jì)末以來, 由于全球性能源短缺以及CO2排放引起的溫室效應(yīng)使得對(duì)于可再生能源的開發(fā)和利用受到了廣泛的關(guān)注。在多種可再生能源中, 按能源當(dāng)量, 生物質(zhì)能源僅次于煤炭、石油和天然氣列第四位, 是國際公認(rèn)緩解能源危機(jī)的有效途徑之一。生物柴油是生物質(zhì)能的一種, 它是以生物體油脂為原料, 經(jīng)轉(zhuǎn)酯作用而形成的單烷基脂肪酸酯, 是一種優(yōu)質(zhì)清潔柴油。發(fā)展生物柴油,原料是關(guān)鍵。微藻被認(rèn)為是最具潛力、能實(shí)現(xiàn)可持續(xù)供給的油脂生物質(zhì)資源之一, 利用微藻生產(chǎn)生物柴油具有多種優(yōu)勢(shì)。在眾多的產(chǎn)油微藻中, 微擬球藻由于具有高的光合作用效率、生物量、油脂含量以及具有成熟的大規(guī)模封閉式光生物反應(yīng)器和開放池的戶外培養(yǎng)體系, 而被認(rèn)為是最有潛力的工業(yè)產(chǎn)油的模式研究藻種[6]。其中鹽生微擬球藻、眼點(diǎn)微擬球藻和加的斯微擬球藻由于具有相對(duì)較高的總脂含量而被研究得較為詳盡[7—9]。特別是, 加的斯微擬球藻因表現(xiàn)出較廣的鹽度(10%—120%的海水鹽度)和pH(7—10)耐受性, 在光自養(yǎng)條件下有高的生物量(>10 g/L)、對(duì)數(shù)期也能合成甘油三酯, 而被作為研究微藻產(chǎn)油的最佳模式生物, 目前其遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立, 全基因組序列已公布[10]。本研究以6種7株微擬球藻為對(duì)象,分析其對(duì)鹽度的耐受性, 比較中性脂的組成和含量, 然后,從中選取兩個(gè)油含量較高、目前應(yīng)用較廣的兩株微擬球藻, 進(jìn)一步研究批量培養(yǎng)條件下藻細(xì)胞油脂的積累規(guī)律和脂肪酸組成, 為利用微擬球藻作為生產(chǎn)生物柴油的原料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻株和培養(yǎng)

兩株海洋微擬球藻(Nannochloropsis oceanica) MBIC10090和PP983分別來自日本生物資源中心(NBRC)和國家海洋局第一海洋研究所李瑞香實(shí)驗(yàn)室, 顆粒微擬球藻(N.granulataMBIC10054)和鹽生微擬球藻(N.salinaMBIC10063)購自日本生物資源中心, 眼點(diǎn)微擬球藻(N.oculataCCAP 849/1)和加的斯微擬球藻(N.gaditanaCCAP 849/5)購自英國藻類和原生動(dòng)物培養(yǎng)中心(CCAP),湖泊微擬球藻(N.limneticaKR 1998/3)由德國Lothar Krienitz教授提供。除屬于淡水的湖泊微擬球藻用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)外, 其他的海洋種類均用f/2AW培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 藻株在海水和淡水中生長的比較

為便于比較, 先將屬于海洋的6個(gè)藻株接種于BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少兩代至對(duì)數(shù)生長期, 然后, 再分別將生長在BG11或f/2AW培養(yǎng)基中的藻細(xì)胞離心收集, 對(duì)應(yīng)接種至含6 mL BG11或f/2AW培養(yǎng)基的15 mL培養(yǎng)試管中; 對(duì)于淡水種類而言, 由于預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示其不能生長在海水中, 因而比較時(shí)直接利用生長于BG11培養(yǎng)基中的藻細(xì)胞接種, 接種起始A730=0.1。靜置培養(yǎng)在20℃、光強(qiáng)為60 μmol photons/(m2·s)的連續(xù)光照下進(jìn)行, 每天至少搖動(dòng)試管2—3次, 7d后測(cè)定A730值及葉綠素a的含量。葉綠素a的含量按照Parsons和Strickland[11]的方法(在90% 的丙酮中)用公式計(jì)算: Chl.a (mg/L)=11.41×A664。

1.3 藻株中性脂含量分析

6株海洋的微擬球藻和1株淡水的微擬球藻分別生長在含400 mL f/2AW和BG11培養(yǎng)基(將氮濃度減少到882 μmol/L NaNO3, 與f/2培養(yǎng)基中的氮濃度一致)的500 mL三角瓶中, 在22℃、100 μmol photons/(m2·s)的連續(xù)光照條件下靜置培養(yǎng)20d至穩(wěn)定期, 收獲藻細(xì)胞提取總脂利用薄層層析法比較中性脂的組成及含量。

藻細(xì)胞的總脂按照Bligh和Dyer[12]的方法提取。經(jīng)6000 r/min離心收集的藻細(xì)胞加入一定體積的氯仿∶甲醇(1∶1), 在旋渦振蕩器上以最大速度振蕩1—2 min, 然后加入3/10體積的1 mol/L氯化鉀的0.2 mol/L磷酸溶液, 稍振蕩后12000 r/min離心5min, 吸取下層氯仿相至新的EP管中, 置于通風(fēng)廚中吹干, ?20℃保存?zhèn)溆?。薄層層析參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。薄層層析板的型號(hào)是Silica gel 60 F254 (Merk KgaA Darmstadt, Germany), 展層劑體系為正己烷∶乙醚∶乙酸(70∶30∶1,v∶v∶v)。展層完畢從展層缸中取出層析板, 置于通風(fēng)櫥內(nèi)吹干展層劑, 然后放置到含有一定量顆粒碘的燒杯中于37℃ 下顯色5—10 min[14]。標(biāo)準(zhǔn)品甘油一硬脂酸酯(Monostearin)、甘油二硬脂酸酯(Distearin)和三油酸甘油酯(Glyceryl trioleate)購自Sigma公司。

1.4 藻株油脂積累分析

將處于對(duì)數(shù)生長期的眼點(diǎn)微擬球藻和加的斯微擬球藻接種到含400 mL f/2AW培養(yǎng)基(將氮濃度減少到500 μmol/L NaNO3)的500 mL三角瓶中, 在22℃、光強(qiáng)為60 μmol photons/(m2·s)的條件下通空氣培養(yǎng), 每天取樣通過尼羅紅染色[15]后, 用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度, 以反映藻細(xì)胞中性脂含量的變化情況, 分析前以A730值為基準(zhǔn)調(diào)整取樣的體積。同時(shí), 測(cè)定培養(yǎng)液的A730值和利用分光光度法(A220)檢測(cè)NO3?的濃度[16]。培養(yǎng)10d后的藻細(xì)胞收集用于測(cè)定總脂含量及其脂肪酸組成。

1.5 總脂含量的測(cè)定及脂肪酸組成分析

6000 r/min離心收集藻細(xì)胞, 用滅菌ddH2O洗滌3次, 將收集的藻細(xì)胞液氮速凍后, 冷凍干燥備用。總脂的提取及定量參照文獻(xiàn)[12]。稱取100 mg干藻粉加入一定體積的氯仿∶甲醇 (1∶2) 溶劑萃取充分, 然后加入一定比例的滅菌ddH2O促使分層, 離心收集下層的氯仿層,轉(zhuǎn)入已稱重的稱量瓶中, N2吹干有機(jī)溶劑, 然后用分析天平稱重, 計(jì)算總脂的含量。

總脂甲酯化按如下步驟進(jìn)行: 將一定量的總脂轉(zhuǎn)移到1.5 mL Aglient 玻璃瓶中, 加入1 mL 1 mol/L的硫酸甲醇溶液, 充N2后密封, 于100℃反應(yīng)1h。冷卻后, 加入200 μL 蒸餾水, 混勻后, 以200 μL正己烷萃取3次, 合并有機(jī)相, N2吹干后定容至100 μL, 取1 μL 用Ultra Trace 氣相色譜分析儀 (Thermo Scientific, United States)進(jìn)行脂肪酸組成分析。

2 結(jié)果與討論

對(duì)于戶外培養(yǎng), 特別是開放池培養(yǎng)而言, 培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)導(dǎo)致培養(yǎng)液的鹽度變化很大。因而, 在篩選具有應(yīng)用前景的藻株時(shí), 鹽度的耐受性是必須考慮的重要因素之一。盡管微擬球藻屬的種類多為海生, 但近年來的研究顯示在淡水中也有廣泛的分布[4], 而有些分離自河口的種類也能在淡水中生長。眼點(diǎn)微擬球藻盡管是海生類型,但在低鹽度(4‰)下仍然生長良好[17], 我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示, 盡管在淡水中該藻細(xì)胞的生長和葉綠素a含量要低于海水(P<0.01,t-test), 但仍然能夠維持生長(圖1)。本研究結(jié)果表明, 所有6株海生微擬球藻均能在淡水中生長, 從藻細(xì)胞葉綠素a含量看, 淡水培養(yǎng)的海生微擬球藻葉綠素的合成并沒有受到明顯抑制, 相反, 對(duì)于海洋微擬球藻PP983和加的斯微擬球藻而言, 淡水培養(yǎng)的藻細(xì)胞葉綠素相對(duì)含量超過(P<0.01,t-test)或接近(P>0.05,t-test)海水培養(yǎng)的藻細(xì)胞, 說明這兩種微擬球藻即使在淡水中也能維持最適的生長狀態(tài)。與此不同的是, 作為淡水的湖泊微擬球藻并不能夠在海水中生長。

除在低鹽度下生長良好外, 多數(shù)海生的微擬球藻還能耐受較高的海水鹽度, 如眼點(diǎn)微擬球藻、加的斯微擬球藻和海洋微擬球藻PP983可耐受的最高鹽度分別為: 54‰、42‰和54‰[10,17,18]。Lubián[19]的研究也顯示加的斯微擬球藻、鹽生微擬球藻和眼點(diǎn)微擬球藻具有較廣的鹽度耐受范圍。由此可見, 除湖泊微擬球藻外, 微擬球藻屬的海生種類對(duì)鹽度變化均有較高的耐受性, 適于在戶外進(jìn)行開放式的培養(yǎng), 特別是加的斯微擬球藻由于在淡水和海水均能維持較適的生長, 顯示出較大的表型可塑性,因而, 具有良好的應(yīng)用前景。

圖 1 七株微擬球藻在f/2AW和BG11中培養(yǎng)7d后的A730值(A)及藻細(xì)胞相對(duì)葉綠素a含量(B)Fig.1 Growth (A730) and relative amount chlorophyll a of seven Nannochloropsis strains cultured for 7 day in f/2AW and BG11 medium

圖2 七株微擬球藻總脂的硅膠板薄層層析圖Fig.2 Comparison of lipid composition and content in Nannochloropsis species by thin layer chromatography

將7株微擬球藻在氮濃度相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期(氮源被消耗完后約3d), 收集藻細(xì)胞后提取總脂進(jìn)行薄層層析分析, 比較它們的中性脂含量及組成(圖2)。薄層層析結(jié)果顯示, 所有藻株均含有不同量的一酯、二酯和三酯, 其中甘油三酯的量最大。除海洋微擬球藻MBIC10090的甘油三酯量略低外, 其他6株微擬球藻細(xì)胞中含有的甘油三酯量相當(dāng)?？梢姀挠椭可峡? 這些微擬球藻均可作為生產(chǎn)生物柴油的原料。與我們的研究不同, 李秀波等[20]在淡水微擬球藻中僅檢測(cè)到了很低的甘油三酯含量, 這與他們所使用的BG11培養(yǎng)基具有較高的氮濃度有關(guān), 因?yàn)橥瑫r(shí)收獲低(882 μmol/L)和高(17.6 mmol/L)兩種氮濃度下培養(yǎng)的海水和淡水微擬球藻會(huì)導(dǎo)致淡水微擬球藻的生長仍然處于氮豐富條件。

為了解批量培養(yǎng)條件下微擬球藻油脂積累的規(guī)律,我們以加的斯微擬球藻和眼點(diǎn)微擬球藻為對(duì)象, 通過尼羅紅染色熒光分光光度法測(cè)定了藻細(xì)胞中的中性脂含量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化及其與培養(yǎng)基中氮濃度的關(guān)系(圖3)。結(jié)果顯示, 在培養(yǎng)的第6天, 培養(yǎng)液中的NO3?基本被消耗殆盡, 而藻細(xì)胞中的中性脂則在培養(yǎng)的第7天開始增加, 加的斯微擬球藻在缺氮后2d, 細(xì)胞的中性脂有明顯增加的趨勢(shì), 且增加的幅度明顯高于眼點(diǎn)微擬球藻。從生長上看, 2個(gè)藻株的比生長速率相當(dāng), 但加的斯微擬球藻的生物量要大于眼點(diǎn)微擬球藻。

許多研究表明, 對(duì)數(shù)生長后期藻細(xì)胞可開始積累油脂, 至穩(wěn)定期積累的油脂可達(dá)到最大值[7,21]。盡管加的斯微擬球藻細(xì)胞中與甘油三酯合成相關(guān)的基因具有組成型表達(dá)的特性[10], 但我們的結(jié)果顯示, 缺氮仍然可以顯著促進(jìn)藻細(xì)胞中性脂的積累, 這可能是氮缺乏導(dǎo)致其他代謝路徑的改變, 從而促進(jìn)了細(xì)胞脂質(zhì)的合成。

將培養(yǎng)10d的加的斯微擬球藻和眼點(diǎn)微擬球藻收獲用于分析藻細(xì)胞的總脂含量及其脂肪酸組成。表1顯示兩種微擬球藻的總脂含量均超過50%, 其脂肪酸組成以C16:0和C16:1為主, 兩者之和占總脂肪酸的70%左右。此外, C14:0和C18:1兩種脂肪酸約占15%—17%; 微擬球藻屬中最主要的多不飽和脂肪酸EPA在兩種藻中的含量約為8%—10%, 較低的EPA含量與培養(yǎng)基中的氮濃度和收獲期有關(guān), 氮限制或穩(wěn)定期收獲均導(dǎo)致多不飽和脂肪酸含量下降[22]。我們的結(jié)果顯示, 盡管微擬球藻具有較高的多不飽和脂肪酸, 但在培養(yǎng)液缺氮數(shù)天后收獲藻細(xì)胞,最終使得加的斯微擬球藻多不飽和脂肪酸含量不超過12%, 符合作為生物柴油原料的歐洲標(biāo)準(zhǔn)。

圖 3 不同生長時(shí)期所對(duì)應(yīng)的兩種微擬球藻的細(xì)胞密度(A)、培養(yǎng)液NO3?濃度與尼羅紅染色熒光強(qiáng)度(B)Fig.3 Cell density (A), NO3?concentrations in medium and oil content (B) of Nannochloropsis sp.cultured at different growth phase NOc.N.oculata; NGa.N.gaditana

表1 加的斯微擬球藻和眼點(diǎn)微擬球藻的脂肪酸組成及其總脂含量(占藻細(xì)胞干重)Tab.1 Fatty acid composition (mol %) and total lipid content (% dry cell weight) of Nannochloropsis gaditana and N.oculata

本研究通過比較產(chǎn)油的7株微擬球藻對(duì)鹽度的耐受及其油脂積累的規(guī)律, 綜合多方面的特性, 發(fā)現(xiàn)加的斯微擬球藻具有較廣的鹽度耐受范圍、高的生物量、高的中性脂含量、缺氮后油脂快速積累的能力及合適的脂肪酸組成, 因而, 是一種有應(yīng)用前景的產(chǎn)油微藻, 在戶外進(jìn)行開放式培養(yǎng), 可望成為低廉的微藻生物柴油原料。

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STUDY ON THE SALINITY TOLERANCE AND OIL ACCUMULATION IN NANNOCHLOROPSIS

HUANG Wei-Chao1,2and HU Han-Hua1
(1.Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

微擬球藻; 三?；视? 生物柴油; 鹽度耐受

Nannochloropsis; Triacylglycerols; Biodiesel; Salinity Tolerance

Q949.2

A

1000-3207(2013)02-0383-05

10.7541/2013.31

2012-03-21;

2012-12-07

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011CB200901)資助

黃偉超(1986—), 女, 河北石家莊人; 碩士研究生; 主要從事藻類生物技術(shù)研究。E-mail: huangweichao88@126.com

胡晗華, E-mail: hanhuahu@ihb.ac.cn